ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ ВИДА BACILLUS ANTHRACIS МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР)
- Название (рус.)
- ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ ВИДА BACILLUS ANTHRACIS МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР)
- Состав и форма выпуска
- Состоит из трех наборов и рассчитана на проведение 50 анализов:
Наименование Количество Упаковка Набор 1 - для выделения ДНК Буфер выделения 5 мл 1 флакон Буфер гомогенизации 25 мл 1 флакон Набор 2 - для выявления B. anthracis методом ПЦР Фермент Tag-полимераза (5 ед/мкл) 13 мкл 1 пробирка Праймеры для ПЦР 225 мкл 1 пробирка Положительный контроль (рекомбинантная ДНК B. anthracis) 50 мкл 1 пробирка Буфер для ПЦР 800 мкл 1 пробирка Вода деионизованная 2 мл 1 флакон Масло 2 мл 1 флакон Набор 3 - для электрофореза Агароза 5 г 1 пакет Буфер для электрофореза (TAE, 50-кратный) 20 мл 1 флакон Бромистый этидий (10 мг/мл) 150 мкл 1 пробирка Буфер для нанесения образца на гель 300 мкл 1 пробирка
При соблюдении наставления по применению анализ занимает 6 - 8 часов. Компоненты наборов расфасовывают в полипропиленовые флаконы фирмы <Прометей> вместимостью 20 мл, микропробирки и пробирки фирмы Porex Bio Products Group (США) вместимостью 05 - 2 мл и 5 мл. - Фармакологические свойства
- Идентификация бактерий вида Bacillus anthracis основана на обнаружении и амплификации фрагмента гена капсулообразования CapB с помощью полимеразной и цепной реакции, которая представляет собой многократное цикличное повторение трех процессов: тепловая денатурация ДНК в исследуемой пробе; гибридизация (<отжиг>) исследуемой ДНК со специфическими олигонуклеотидными зондами (праймерами); синтез комплементарных цепей ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы. выделение суммарной ДНК; ПЦР, то есть реакция амплификации фрагмента гена CapB; электрофорез продуктов ПЦР в агарозном теле. Результаты электрофореза являются основанием для заключения о наличии или отсутствии возбудителя сибирской язвы в исследуемом образце.
- Показания
- Для выявления и идентификации бактерий вида bacillus anthracis (возбудитель сибирской язвы), содержащих ген капсулообразования (Сар И). Данная тест-система позволяет обнаружить капсулообразующие бактерии Bacillus anthracis в вегетативной форме в микробиологических культурах и жидких пробах из объектов окружающей среды в концентрации 10³ кл/мл, а также в патматериале от больных и павших животных (кровь, селезенка, сердце, печень) в концентрации 2 х 10³ кл в 1 г ткани.
- Дозы и способ применения
- Подготовка исследуемого материала и выделение ДНК. Подготовку образцов проводят в изолирующем боксе, в условиях работы с микроорганизмами 2 группы опасности. Все операции выполняют стерильными инструментами с использованием стерильной, химически чистой стеклянной и одноразовой пластиковой посуды. Жидкие пробы (вода, суспензии бактерий, смывы) в объеме 1 мл помещают в полипропиленовые пробирки объемом 1,5 мл и центрифугируют 5 минут в настольной центрифуге при 10000 об/мин. Надосадочную жидкость осторожно удаляют. Осадок суспендируют в 100 мкл при 10000 об/мин. Надосадочную жидкость используют для проведения. (Примечание: чтобы избежать самопроизвольного открывания пробирок при нагревании следует придавить их сверху грузом или использовать специальные пробирки с защелкой). Во избежание перекрестной контаминации до начала работы маркируют чистые пробирки и вносят в них по 100 мкл буфера выделения. После этого приступают к работе с инфицированным материалом. Пробы патматериала от больных или павших животных: кусочки селезенки, лимфоузлов, сердца, примерно, по 0,5 г - растирают с помощью стеклянного гомогенизатора Поттера или в фарфоровой ступке и гомогенизируют в 0,5 мл буфера гомогенизации. Гомогенат осветляют центрифугированием при 5000 об/мин, 100 мкл надосадочной жидкости смешивают с 100 мл буфера выделения, прогревают 20 минут при 100 °C, центрифугируют 5 минут при 10000 об/мин. Надосадочную жидкость используют для проведения ПЦР. Пробы крови животных в объеме 100 мкл смешивают с 100 мкл буфера выделения, прогревают 20 минут при 100 °C, затем центрифугируют 5 минут при 10000 об/мин. Надосадочную жидкость используют для проведения ПЦР. Проведение реакции амплификации ДНК. В отдельной пробирке готовят общую реакционную смесь на N образцов с учетом положительного и отрицательного контролей:
Реактив Количество на 1 пробу (мкл) Количество на N проб Буфер для ПЦР-2 15,25 15,25 х (N+1) Праймеры для ПЦР-2 4,5 4,5 х (N+1) Tag-полимераза 0,25 0,25 х (N+1)
Работу желательно проводить на холоде.
Реактивы смешивают в последовательности, как они перечислены в таблице. Последним вносят фермент Tag-полимеразу. Смесь перемешивают и разливают по 20 мкл в предварительно промаркированные пробирки для ПЦР. В каждую пробирку раскапывают по 2 - 3 капли масла (примерно 40 мкл). В последнюю очередь в соответствующие пробирки вносят по 5 мкл ДНК, выделенной из анализируемых проб, перемешивают пипетированием (4 5 раз), затем пробы помещают в амплификатор со следующим температурным режимом:
94 °C - 0,5 минут
50 °C - 0,5 минут 30 циклов
72 °C - 0,5 минут
Контроли - положительный и отрицательный. В каждой серии анализов параллельно проводят реакции с контрольными образцами: положительным контролем (K+) служит рекомбинантная (плазмидная) ДНК B. anthracis (5 мкл). Отрицательным контролем (K-) служит деионизованная вода (5 мкл). Смеси для контрольных образцов готовят по той же прописи, что и для исследуемых образцов. На всех этапах анализа в первую очередь проводят манипуляции с отрицательным контролем, затем с исследуемыми образцами и в последнюю очередь с положительным контролем.
Учет результатов амплификации. Продукты ПЦР анализируют методом электрофореза в агарозном геле с помощью. Набор 3 для электрофореза. Приготовление буфера для электрофореза. Для приготовления 1 л однократного буфера к 20 мл 50-кратного буфера для электрофореза (50 х TAE) добавляют 980 мл дистиллированной воды и 40 мкл раствора бромистого этидия. Примечание. Буфер можно приготовить самостоятельно по следующей прописи: навеску 4,04 г. Триса (гидроксиламинометана) растворяют в 200 мл дистиллированной воды, добавляют 1,14 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл 0,5 М раствора ЭДТА pH 8 и доводят объем до 1000 мл дистиллированной водой. После растворения всех компонентов добавляют 40 мл раствора бромистого этидия. Приготовление агарозного геля. К 100 мл однократного буфера для электрофореза добавляют 2 г. агарозы и нагревают на электроплите или в микроволновой печи до полного растворения агарозы. Расплавленную агарозу охлаждают до 45 °C, постоянно перемешивая, размешивают, заливают в специальную форму с гребенкой и дают затвердеть. Форму с образовавшимся агарозным гелем переносят в аппарат для горизонтального электрофореза, погружают в буфер и осторожно вынимают гребенку. Оставшуюся часть затвердевшей агарозы можно повторно расплавить и использовать для приготовления геля. Электрофорез продуктов амплификации. В пробирки с исследуемыми образцами после завершения амплификации вносят по 3 мкл буфера для нанесения образца и по 10 мкл окрашенной водной фазы вносят в лунки агарозного геля, образовавшиеся от зубцов требенки. Электрофорез проводят при напряжении 8 вольт/см длины геля до тех пор, пока краситель пройдет от старта не менее половины геля (примерно 30 - 60 минут). Направление движения образцов в геле от <минуса> к <плюсу>.
Учет результатов электрофореза. Результаты электрофореза учитывают, просматривая гель в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе <Трансиллюминатор>
Амплифицированные фрагменты ДНК выявляются в виде светящихся красноватых полос.
Положительными (содержащими ДНК капсульного штамма Bacilus anthracis) считают пробы, полосы в которых располагаются в геле точно на таком же расстоянии от старта, что и полоса положительного контроля (фрагмент длиной 300 п. н.). В отрицательном контроле не должно выявляться никаких полос. Исследуемые пробы считают отрицательными, если в них не выявлено никаких полос или полосы не соответствуют по размеру фрагменту в контрольной пробе (т. е. располагаются на другом расстоянии от старта). Присутствие в отрицательном контроле окрашенных фрагментов на уровне полос положительного контроля свидетельствует о перекрестной контаминации в процессе анализа. Результаты аннулируются. Анализ необходимо провести заново. Для документирования полученных результатов используют фотопленку <Микрат - 300> и аппарат типа <Зенит> с оранжевым светофильтром, либо другие фото- и видеосистемы. - Особые указания
- Бромистый этидий является мутагеном, проникающим через кожу. При работе с ним использовать резиновые перчатки. Бромистый этидий разлагается на свету и при нагревании. Содержащие его растворы хранят в темном месте. При длительном хранении или многократном нагревании в них следует внести свежую порцию бромистого этидия (5 мкл на 100 мл буфера) перед употреблением. Ультрафиолет вызывает ожоги слизистой оболочки глаз. При просмотре гелей пользоваться защитным экраном или очками. Строгое соблюдение условий хранения компонентов тест-системы. Однократное использование пластиковой посуды. Ранее использованные и мытые наконечники и пробирки использовать нельзя. Посуда для отбора образцов биоматериала должна быть одноразовой или тщательно обработана хромпиком, отмыта, простерилизована.
- Условия хранения
- Набор 1 - при температуре от 2 до 6 °C, набор 2 - при температуре от минус 18 до минус 20 °C, набор 3 - при температуре от 2 до 6 °C. Транспортирование проводится при температуре от 0 °C до 2 °C. Срок годности - 12 месяцев.
- Производитель
- НАРВАК НПО ЗАО, Россия
Адрес: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 16.
Тел./факс: (495) 916-10-67, 916-17-05, 916-11-59,
190-75-61, 190-28-72, 190-30-54, 787-69-32, 787-69-33 - Продавец
- Место Вашей рекламы
По вопросам размещения информации
о ветеринарных препаратах и кормовых добавках
в Электронном справочнике "Ветеринарные препараты в России"
и заключения договоров на публикацию
обращайтесь в ООО "Ветторг" по электронной почте: vettorg@mail.ru
