ВЕТТОРГ ⇨ Каталог препаратов ⇨ ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА И ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИТРА АНТИТЕЛ К ВИРУСУ КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ (КЧС) В РЕАКЦИИ МИКРО НЕЙТРАЛИЗАЦИИ С ПОМОЩЬЮ ЦИТОХИМИЧЕСКОГО ВАРИАНТА ИММУНОФЕРМЕНТНОГО МЕТОДА (ЦВИА)

ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА И ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИТРА АНТИТЕЛ К ВИРУСУ КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ (КЧС) В РЕАКЦИИ МИКРО НЕЙТРАЛИЗАЦИИ С ПОМОЩЬЮ ЦИТОХИМИЧЕСКОГО ВАРИАНТА ИММУНОФЕРМЕНТНОГО МЕТОДА (ЦВИА)

Название (рус.)

Состав и форма выпуска

Диагностический набор состоит из упакованного в коробку комплекта препаратов: Лиофилизированный иммуноглобулин (сыворотка) кролика (IgG, 10 - 20 мкг/0,1 мл), специфический к вирусу КЧС (№ 1) - 1 ампула, содержащая 0,1 мл; Лиофилизированный атенуированный вирус КЧС, штамм <ЛК-ВНИИВВиМ> (№ 2) - ампула, содержащая 1 мл (0,5 lgИД 50/0,5 мл); Лиофилизированный положительный контрольный иммуноглобулин (IgG) сыворотки свиньи (№ 3) - 1 ампула, содержащая 0,2 мл; Лиофилизированный отрицательный контрольный иммуноглобулин (IgG) сыворотки свиньи (№ 4) - 1 ампула, содержащая 0,2 мл; Лиофилизированный конъюгат антител, специфических к IgG кролика, конъюгированных с пероксидазой хрена (№ 5) - 1 ампула, содержащая 0,2 мл; 0,05 М ацетатный буфер, pH 5 (№ 6) - 1 флакон - 10 мл; 1 М концентрат фосфатно-буферного раствора (ФБР), pH 7,2 - 7,4 (№ 7) - 1 флакон 6 мл. Детергент твин-20, жидкий (№ 8) - 1 флакон 6 мл; Детергент твин - 20, жидкий (№ 8) - 1 флакон 0,6 мл; Натрий хлористый (№ 9) - 1 флакон 5,1 г; n-диметил-формамид (№ 10) - 1 флакон 0,3 мл; 3-амино-9-этилкарбазол (АЭК) (№ 12) - 1 флакон 5 г; Сухое обезжиренное молоко (№ 12) - 1 флакон 5 г. Плоскодонные стерильные культуральные полистироловые планшеты 96-луночные - 1 шт. Компоненты выпускают в закрытых флаконах (ампулах).

Фармакологические свойства

Заключается в размножении вируса КЧС в чувствительной культуре клеток с последующим выявлением антигена в инфицированных клетках с помощью высокочувствительных, специфических реагентов. Специфический комплекс антиген-антитело в культуре инфицированных клеток может выявляться в двух вариантах постановки ЦВИА: а) с помощью специфических меченых антител (прямой вариант); б) с помощью специфических антител и конъюгата антивидовых меченых антител (непрямой вариант). Индикатором специфического иммунокомплекса антиген-антитело, образовавшегося на твердой фазе служит ковалентно связанный фермент (пероксидаза хрена), визуализируемый в результате реакции фермента с хромогенным субстратом, что позволяет учитывать реакцию под световым микроскопом или автоматическим спектрофотометром. На проведение исследования требуется 4 - 5 дней.

Показания

Для выявления вируса КЧС в крови и суспензии органов от павших или вынужденно убитых животных при подозрении на классическую чуму свиней. Метод позволяет определить биологическую активность (титр) вакцинного штамма вируса на различных стадиях изготовления вакцины, а также выявлять титр специфических нейтрализующих антител в сыворотке крови свиней и лабораторных животных. Расчет титра вируса и титра противовирусных антител в референтных и тестируемых сыворотках рассчитывают по таблицам с использованием метода Кербера.

Дозы и способ применения

Для выявления вируса классической чумы свиней берут пробы крови, кусочки селезенки, миндалин, лимфоузлов, грудной кости (костный мозг), почек и легких от 2 - 3 животных в первые 2 ч после гибели или вынужденного убоя больных или подозреваемых в заболевании. Материалом для исследования, кроме того, могут служить вируссодержащие инфицированные вирусом культуры при оценки сырья при производстве вакцины. Материал отбирают в стерильные флаконы, закрывают резиновыми пробкам, флаконы обрабатывают снаружи дезинфицирующим раствором. Отобранный материал консервируют растворами антибиотиков. На флаконы наклеивают этикетки с указанием вида животного, наименования материала и его количества, времени получения и почтового адреса отправителя и замораживают. Поступившие на исследование материалы освобождают от консервирующей жидкости 2 - 3-х кратным отмыванием в стерильном ФБР с антибиотиками, взвешивают, измельчают сначала ножницами, а затем в гомогенизаторе, смешивая 1 - 5 или 1 к 10 с питательной средой для культивирования клеток с добавлением антибиотиков Б 6 мкг/мл, неомицина с бацитрацином 150 мгк/мл. Полученную 10 - 20 % суспензию центрифугируют 10 минут при 2000 об/мин, собирают надосадочную жидкость, которая служит исследуемым материалом для выделения вируса. Суспензия инфицированных вирусом клеточных культур и аттенуированных культуральных вакцин исследуют в цельном виде. Культура клеток, используемая для репродукции вируса, должна быть проверена на отсутствие контаминаций вирусом диареи крупного рогатого скота. Сыворотку, используемую для выращивания культур клеток, также проверяют на отсутствие антигена и антител вируса диареи крупного рогатого скота. Проведению исследования испытуемого материала методом цитохимического варианта реагентов. Готовят фиксирующий раствор (в комплект не входит) для фиксации монослоя клеток после инкубации (в работе используют один из ниже перечисленных вариантов фиксирующего раствора №№ 1 - 4. № 1 CH3COCH - 300мл - ацетон; ФБР - 700 мл; БСА - 200 мг - бычий сывороточный альбумин. № 2 C2H5OH - атанол абсолютный. № 3 (extemp) HCO(CH)CHO - 0,025 мл - глутаровый альдегид; ФБР - до 100 мл. № 4 4 % р-р параформальдегида на ФБР. Содержимое флакона № 2 (лиофилизированный аттенуированный вирус КЧС, штамм <ЛК-ВНИИВВиМ>) следует растворить в 1 мл ростовой среды и приготовить рабочее разведение 100 - 300 ТЦД (довести содержимое флакона до 100 мл ростовой средой). Содержимое ампул с положительным (положительный контроль № 3) и отрицательными иммуноглобулинами свиньи к вирусу КЧС (отрицательный контроль № 4) растворяют в 0,2 мл культуральной среды. Содержимое флакона № 7 необходимо растворить в 600 мл бидистиллированной воды. В полученный раствор добавить из флакона № 9 хлористый натрий и из флакона № 8 Твин-8, получаем раствор ФБР-Твнн. В отдельную емкость отобрать 100 мл раствора ФБР-Твин и растворить в этом объеме буфера взятое из флакона № 12 сухое молоко. Полученный блокирующий раствор (ФБР-Твин-Молоко) используется для блокирования планшетов после фиксации и для приготовления разведений лиофилизированного иммуноглобулина кролика (сыворотки), специфического к вирусу КЧС (№ 1), антикроличьего конъюгата (№ 5) в разведении, указанном на этикетках. Оставшиеся 500 мл раствора ФБР-Твин используют для отмывки полистироловых планшетов. Субстрат-индикаторный раствор: содержимое флакона № 11 (АЭК) растворяют в содержимом флакона № 10. Полученный матричный раствор можно приготовить заранее и хранить в темноте при комнатной температуре. Перед использованием смешать 0,3 мл матричного раствора с 5 мл 0,05 М ацетатного буфера pH 5 (№ 6) и добавить 0,006 мл, H2O (в набор не входит). Приготовленный раствор АЭК должен быть прозрачным, желто-коричневого цвета, его необходимо защищать от прямого источника света (лучше использовать флакон из темного стекла). Выделение (титрация) вируса КЧС из патматериала. Готовят 100-кратный концентрат раствора антибиотиков и глутамина. Глутамин (2,92 г) растворяют в 50 мл дистиллированной воды (раствор А) и стерилизуют фильтрацией. Антибиотики: пенициллин 10 МЕ, стрептомицин - 1 г, микостатин 5 х 10 Е, полимиксин В 15 х 1 - Е и канамицин - 1 г, растворяют в 5 - 10 мл стерильной дистиллированной воды (раствор В). Растворы А и В смешивают и доводят стерильной дистиллированной водой до 100 мл, хранят до использования в аликвотах по 1 мл при минус 20 °C. В стерильных условиях отрезают 1 - 2 миндалины или селезенки, добавляют небольшое количество стерильного стеклянного песка с культуральной средой и тщательно гомогенизируют в стерильной ступке или стеклянном гомогенизаторе. Из гомогената готовят 20 % (вес/объем) суспензию на культуральной среде Игла МЕМ, добавляют 1 мл смеси глутамина с антибиотиками на каждые 10 мл суспензии гомогената ткани и инкубируют при комнатной температуре 1 ч. Суспензию осветляют низкоскоростным центрифугированием при 3000 - 6000 об/мин 15 минут. В работе используют супернатант. Монослой кульутуры клеток P - 15 трипсинизируют, суспензию клеток при 800 - 1000 об/мин 10 минут и ресуспендируют в ростовой среде (Игла МЕМ, 5 - 10 % фетальной сыворотки, свободной от антител к вирусу диареи крупного рогатого скота 0,2 мл смеси антибиотики с глутамином на 10 мл клеточной суспензии) до концентрации клеток 2 х 10 кл/см. Смешивают 1 часть супернатанта и 9 частей суспензии клеток и вносят в лунки 96-луночного планшета по 0,1 - 0,2 мл в лунку. При титрации вируса, в отдельной стерильной посуде готовят серийные разведения вируса на среде, используемой для культирования клеток, без сыворотки с антибиотиками. Как минимум готовят 6 - 8 последовательных разведений. Кратность и объем разведения могут варьировать в зависимости от поставленной задачи и объема исследуемого материала (количества образцов для тестирования). При кратности разведения 1: 2 шаг составляет 0,3 lg; 1 к 3 - 0,4 lg; 1 к 4 - 0,6 lg; 1 к 5 - 0,7 kg. Подготовленные разведения вируса переносят многоканальной пипетки с 2 наконечниками, не меняя наконечников, начиная с наивысшего разведения, в культуральные планшеты по 0,05 мл в лунку. Готовят суспензию и во все лунки планшета вносят по 0,05 мл суспензии на ростовой среде с концентрацией клеток 1 - 3 кл/мл. Планшет закрывают пластиковой крышкой или заклеивают скотчем, осторожно перемешивают и помещают в CO2-byre,fnjh ghb 37 С на 3 - 4 сут. Ежедневно просматривают планшеты под инвертированным микроскопом для исключения появления дегенерации клеток или ЦПД, вызванного контаминацией сопутствующими вирусами или бактериями. Определение титра нейтрализующих антител к вирусу КЧС в реакции нейтрализации. Все сыворотки, исследуемые в реакции нейтрализации, инактивируют при 56 C 30 минут. Скрининг на наличие антител к вирусу КЧС: разводят сыворотки 1/10 на ростовой среде и добавляют по 0,05 мл разведенной сыворотки по 2 лунки на образец. Контрольную сыворотку свиньи (ампула № 3) используют как положительный контроль в разведении 1/200. Определение титра вируснейтрализующих антител: Используют одну из перечисленных схем разведения сывороток крови свиней. А. <4-х точечный> - тест без контроля токсичности. На одной панели исследуют 24 сыворотки в двух разведениях 1 к 4 и 1 к 8, каждое, а во все лунки четных рядов вносят по 0,025 мл среды без сыворотки с антибиотиками. Затем в нечетные ряды вносят инактивированную сыворотку (разведение 1 к 4) в объеме 0,05 мл, а в четные ряды эту же сыворотку в объеме 25 мкл, получая разведение 1 к 8. Например, образец сыворотки № 1 вносят в объеме 0,05 мл в лунки A 1 и B 1 и в объеме 0,025 мл в лунки A 2 и B 2, сыворотку № 2 вносят в объеме 0,025 мл в лунки C 1 и D 1 и по 0,025 мл в лунки C 2 и D 2 и т. д. Для сыворотки 3, 4 и т. д. В. <4 точечный> тест с контролем токсичности сыворотки. На одной панели исследуют 16 сывороток. Каждую сыворотку исследуют в двух разведениях, причем первое разведение одновременно служит контролем токсичности сыворотки. Во все лунки в колонках 1, 4, 7, 10 вносят по 0,05 мл среды без сыворотки с антибиотиками, лунки колонок 2, 5, 8, 11 оставляют свободными, а в лунки колонок 3, 6, 9, 12 вносят по 0,025 мл среды. Затем готовят соответствующие разведения сыворотки. Так например, для сыворотки № 1 в лунки A 1 и B 1 и в лунки A 2 и B 2 вносят по 0,05 мл инактивированной сыворотки, а в лунки A 3, B 3 по 0,025 мл, аналогично для сыворотки № 2 в лунки C 1 в лунки C 1, D 1и C 2 и D 2 вносят по 50 мкл инактивированной сыворотки, а в лунки C 3 и D 3 по 0,025 мл и т. д. для последующих образцов сыворотки. С. Более точным и воспроизводимым является следующая схема постановка реакции нейтрализации, при которой сыворотка исследуется в 4 разведениях. При этом панель разбивается на 12 кластеров, которые позволяют исследовать 12 сывороток, каждое разведение в двух повторах. При постановке данного варианта поступают следующим образом: ряды A и E оставляют свободными, а во все остальные вносят по 0,05 мл среды без сыворотки с антибиотиками. Для приготовления разведений в лунки рядов A и E вносят инактивированную сыворотку в разведении ¼ в объеме 0,1 мл. Далее, используют многоканальную пипетку методом переноса готовят серийные разведения, причем из последнего разведения (ряды B и H) для выравнивания объема удаляют 0,05 мл. Д. При исследовании сыворотки от иммунных животных после переболевания, вакцинации целесообразно использовать <развернутую> схему постановки реакции микронейтрализации (РМН). При <развернутой> схеме на одной панели исследуют 6 сывороток в 8 разведениях, в 2 повторах. При этом лунки ряда A оставляют свободным, а во все остальные лунки панели вносят по 0,05 мл среды без сыворотки с антибиотиками. Затем в ряд А и В вносят в двух повторах образцы сыворотки после инактивации в объеме 0,05 мл, и, начиная с ряда B, используя 12-канальную пипетку, методом переноса готовят серийные разведения с шагом 2. Из ряда H для выравнивания объема удаляют 0,05 мл последнего разведения. При подготовке серийных разведений сывороток для четырех вариантов на одной панели размещается: по варианту А - 24 сыворотки в 2 разведениях без контроля токсичности; по варианту В - 16 сывороток в 2 разведениях с контролем токсичности; по варианту С - 12 сывороток в 4 разведениях; по варианту Д - 6 сывороток в 8 разведениях. Вместо контролей на токсичность можно ставить контроль на активность вируса. Контрольную сыворотку свиньи (ампула № 3) используют как положительный контроль в разведении 1/200 или также подвергая титрации. В лунках с разведениями сывороток добавляют суспензию вируса КЧС в рабочем разведении, содержащем 100 - 300 ТЦД50 в 0,05 мл. Смесь антиген-антитела инкубируют 1 ч при температуре 37 °C. Готовят суспензию клеток и во все лунки планшета вносят по 0,05 мл суспензии на ростовой среде с концентрацией клеток 1 - 3X106 кл/мл. Планшет закрывают пластиковой крышкой из заклеивают скотчем, осторожно перемешивают и помещают в CO2 инкубатор при 37 °C на 3 - 4 суток. Ежедневно просматривают планшеты под инвертированным микроскопом для исключения появления дегенерации клеток или ЦПД, вызванного контаминацией сопутствующими вирусами или бактериями. Постановка ферментативной реакции. Фиксация клеток. После окончания инкубации удаляют поддерживающую среду и в лунки вносят ФБР для промывания монослоя клеток и после аккуратно удаляя. Вносят по 0,1 мл на лунку одного из перечисленных фиксирующих растворов: абсолютный этанол (охлажденный до минус 20 °C) на 45 минут или параформальдегида на 5 - 10 минут. Клетки, выращенные и зараженные на стекле, фиксируют охлажденным ацетоном. Фиксирующий раствор удаляют, а монослой на планшетах высушивают в термостате при 37 или 70 °C. Реакцию ставят через три часа (период, достаточный для полного высыхания поверхности фиксированных клеток). Планшеты можно хранить в герметически закрытых пакетах при минус 20 °C до момента их использования в работе. Постановка реакции. В лунки с фиксированными высушенными клетками добавляют по 0,1 мл блокирующего раствора на 30 минут 37 °C, удаляют содержимое лунок. Вносят положительную антисыворотку кролика к антигену КЧС в рабочем разведении на блокирующем растворе по 0,1 мл/лунка, планшеты инкубируют в термостате при 37 °C при помешивании 30 - 60 минут, удаляют содержимое лунок. Планшеты промывают 3 - 4 раза промывочным буфером (ФБР-Твин) комнатной температуры, удаляют содержимое лунок. Добавляют антикроличий пероксидазный конъюгат в рабочем разведении по 0,1 мл на лунку, инкубируют при 37 °C при помешивании 30 - 60 минут, удаляют содержимое лунок Планшеты промывают 3 - 4 раза промывочным буфером (ФБР-Твин) комнатной температуры, удаляя содержимое лунок. Добавляют свежеприготовленный субстрат 0,05 мл на лунку, инкубируют в термостате при 37 °C 15 - 30 минут. Когда цвет проявится достаточно интенсивно, раствор субстрата удаляют и добавляют H2O по 0,1 мл на лунку. Учет и оценка реакции. Учет реакции производят под инвертированным или обычным световым микроскопом при увеличении 5 х 20 и выше. Проводят оценку результатов по контрольным лункам планшета: положительный контроль при раститровке окрашивается в красно-коричневый цвет различной интенсивности. В лунках с отрицательным контролем поверхность клеток остается неокрашенной или незначительно розовеет. Цитоплазма клеток, инфицированных вирусом классической чумы свиней, будет окрашена в темно-красный, красно-коричневый цвет, а неинфицированные вирусом классической чумы свиней клетки будут иметь бледно-розовый оттенок или вообще не окрасятся. При визуальном учете сравнивают окраску содержимого лунок планшета испытуемых проб с окраской лунок контрольных образцов. За титр испытуемого вируса или сыворотки принимают последнее разведение, при котором наблюдают видимое окрашивание отдельных фокусов клеток монослоя в лунках. Поскольку в каждую лунку с разведениями сыворотки вносят разный объем вирусной суспензии (50 мкл), кратность разведения сыворотки УДВАИВАЕТСЯ. При оценке результатов без раститровок испытуемых проб вируса или сывороток, реакцию оценивают по принципу - <да> - положительная реакция, в пробе выявлены антитела или вирус КЧС или <нет> - отрицательная реакция - в пробе отсутствует специфическая окраска (антитела к вирусу КЧС или вирус КЧС в пробах отсутствует).

Условия хранения

Не допускается хранение при минусовой температуре. Транспортируют при температуре от 2 °C до 8 °C. Срок годности - 12 месяцев.

Производитель

НАРВАК НПО ЗАО, Россия

Адрес: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 16.
Тел./факс: (495) 916-10-67, 916-17-05, 916-11-59,
190-75-61, 190-28-72, 190-30-54, 787-69-32, 787-69-33

Подробнее о производителе

Продавец

Место Вашей рекламы

По вопросам размещения информации

о ветеринарных препаратах и кормовых добавках

в Электронном справочнике "Ветеринарные препараты в России"

и заключения договоров на публикацию

обращайтесь в ООО "Ветторг" по электронной почте: vettorg@mail.ru