ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРУСА ТРАНСМИССИВНОГО ГАСТРОЭНТЕРИТА (ТГС) И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ЕГО ОТ РЕСПИРАТОРНОГО КОРОНАВИРУСА СВИНЕЙ (РКВС) МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР)
- Название (рус.)
- ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРУСА ТРАНСМИССИВНОГО ГАСТРОЭНТЕРИТА (ТГС) И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ЕГО ОТ РЕСПИРАТОРНОГО КОРОНАВИРУСА СВИНЕЙ (РКВС) МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР)
- Состав и форма выпуска
- Состоит из следующих наборов:
№ Название набора и количество анализов 1 Набор для выявления РНК вируса ТГС и РКВС методом ПЦР (50 анализов) 2 Набор для выделения РНК (50 образцов) 3 Набор для проведения электрофореза (5 гелей по 10 образцов)
Набор для выявления РНК вируса ТГС и РКВС методом ПЦР (состоит из 8 компонентов):Наименование Количество Упаковка Термостабильная ДНК-полимераза 25 мкл 1 пробирка Мезофильная ревертаза 7 мкл 1 пробирка Инактивированная культура вируса ТГС (положительный контроль) 200 мл 1 пробирка Праймеры ПЦР-1 с нуклеозидтрифатами (dNTPs 2,5 mM каждого): 225 мкл 1 пробирка Праймеры ПЦР-2 с нуклеозидтрифатами (dNTPs 2,5 mM каждого): 225 мкл 1 пробирка Реакционный буфер для ОТ-ПЦР 1600 мкл 1 пробирка Деионизованная вода (отрицательный контроль) 1,5 мл 1 флакон Вазелиновое масло 4 мл 1 флакон Набор для выделения РНК (состоит из 5 компонентов): Наименование Количество Упаковка Раствор № 1 55 мл 1 флакон Раствор № 2 10 мл 1 флакон Раствор № 3 10 мл 1 флакон Сорбент 2 мл 1 пробирка Набор для проведения электрофореза (состоит из 4 компонентов на 5 гелей по 10 образцов): Наименование Количество Упаковка Агароза 5 г 1 флакон 50-кратный TAE буфер для электрофореза 20 мл 1 флакон Раствор бромистого этидия (10 мг/мл) 150 мкл 1 пробирка Буфер для нанесения образца 300 мкл 1 пробирка
При точном соблюдении наставления по применению анализ занимает от 8 до 16 часов (в зависимости от условий выделения). Флаконы и пробирки упаковывают в полиэтиленовые пакеты с наименованием тест-системы и каждого набора. - Фармакологические свойства
- Обнаружение РНК вируса трансмиссивного гастроэнтерита (ТГС) и дифференциация ее от РНК респираторного коронавируса свиней (РКВС) проводится с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). Перед проведением ПЦР необходимо провести реакцию обратной транскрипции (РНК преобразуется в ДНК). В основе метода ПЦР лежит многократное цикличное повторение трех процессов: денатурации ДНК; гибридизации (<отжига>) исследуемой ДНК со специфическими олигонуклеотидными зондами (праймерами); синтеза комплементарных цепей ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы. В результате проведения N циклов амплификации концентрация синтезированного фрагмента в исследуемой пробе увеличивается в 2 раза (например, в миллион раз после 20 циклов), что позволяет учитывать результаты анализа с помощью электрофореза ДНК в агарозном геле. РКВС является делеционным мутантом вируса ТГС. Тест-система устроена таким образом, что после проведения <гнездовой> ПЦР на матрице вируса ТГС образуется фрагмент размером 874 п. н., тогда как на матрице РКВС образуются короткие фрагменты размером 192 - 253 п. н. (в зависимости от штамма). Места посадки праймеров являются консервативными для вирусов ТГС и РКВС, следовательно, условия амплификации также будут одинаковые. С помощью размеров ПЦР-фрагмента происходит дифференцирование двух вирусов.
- Показания
- Для обнаружения вируса ТГС и дифференцирования его от РКВС. С помощью данной тест-системы вирус ТГС может быть обнаружен в инфицированных культурах клеток и патматериале от больных животных (кровь, сперма, фекалии, образцы кишечника, кусочки органов от павших или вынужденно убитых животных).
- Дозы и способ применения
- Выделение РНК из исследуемого биологического материала проводят с помощью Набора для выделения РНК. Подготовка исследуемых образцов - СПЕРМА: 200 мкл сперма переносят в полипропиленовую пробирку на 1,5 мл и используют для анализа. КРОВЬ: Допускается однократное замораживание проб до исследования при температуре минус 8 C - минус 20 C. 200 мкл крови переносят в полипропиленовую пробирку на 1,5 мл и используют для анализа. ТКАНИ: Ткани гомогенизируют в физиологическом растворе или в растворе для выделения № 1. 200 мкл гомогената переносят в полипропиленовую пробирку на 1,5 мл и используют для анализа. ФЕКАЛИИ: суспендируют в фосфатном буфере, затем центрифугируют при 9000 g в течение 10 минут при 4 C. Для выделения РНК используют 200 мкл супернатанта. Выделение РНК для анализа: Образцы исследуемого биологического материала (в объеме до 200 мкл) помещают в полипропиленовые пробирки объемом 1,5 мл и добавляют 1,1 мл раствор № 1. Инкубируют 10 минут при температуре (20 + 2 C), периодически перемешивая. Пробы центрифугируют в настольной центрифуге типа <Эппендорф> 1 минуту при 13000 об/мин. После центрифугирования надосадочную жидкость переносят в чистые пробирки, а осадок отбрасывают. К полученной суспензии добавляют 40 мкл сорбента и инкубируют при температуре (20 + 2 C) в течение 10 минут, 1 - 2 раза перемешивая на смесителе типа
. Затем центрифугируют 15 секунд на микроцентрифуге при 13000 об/мин, надосадочную жидкость отбрасывают. К осадку добавляют 0,1 мл раствора № 2, перемешивают на смесителе типа и осаждают сорбент центрифугированием в течение 15 секунд, надосадочную жидкость отбрасывают. Процедуру повторяют 2 раза. К осадку добавляют 0,1 мл раствора № 3, перемешивают на смесителе типа и осаждают сорбент центрифугированием в течение 15 секунд, надосадочную жидкость отбрасывают. Процедуру повторяют 2 раза. Осадок подсушивают в течение 10 - 15 минут при 56 C с открытой крышкой. К осадку добавляют 30 мкл деионизованной воды, перемешивают и инкубируют 10 - 15 минут при 56 C в закрытых пробирках. Центрифугируют в течение 1 минуты при 13000 об/мин. Отобранную надосадочную жидкость используют для проведения ПЦР. На всех стадиях обработки биоматериала удаление супернатанта производить одноразовыми пластиковыми наконечниками при помощи водоструйного насоса в колбу-ловушку, содержащую дезинфицирующий раствор (3 % хлорамин или 5 % перекись водорода и т. п.) Все манипуляции, связанные с использованием тест-системы ПЦР, проводятся пипеточными дозаторами типа <Ленпипет> следующих объемов: 0 - 20 мкл, 20 - 200 мкл, 0 - 1000 мкл с использованием полипропиленовых пробирок на 1,5 мл (ПО <Ленполимер>) и 0,5 мкл и наконечников к пипеточным дозаторам одноразового использования. Проведение реакции амплификации: Реакцию амплификации проводят, используя Набор для выявления РНК вируса ТГС и РКВС методом ПЦР. Для выявления РНК вируса ТГС и дифференциации его от РКВС был разработан метод ОТ-ПЦР <в одной пробирке>. При данной постановке реакции стадия обратной транскрипции и стадия амплификации проходят в одной пробирке, последовательно. При этом преимуществом является то, что данная постановка реакции уменьшает вероятность получения ложноположительных результатов, т. к. не требуется дополнительного открывания пробирок. Пробирки для ОТ-ПЦР подготавливают, пронумеровав их и поставив их в штатив по порядку. Вместе с пробирками для исследуемых проб подготавливают пробирки для K+ (РНК, выделенная из 20 мкл контрольной культуры, прилагающейся к набору и K- (деионизованная вода). Подготавливают смесь для ОТ-ПЦР по следующей схеме: (в число пробирок N входят и контроли) Реактив на 1 пробу (мкл) на проб Реакционный буфер для ОТ-ПЦР (p-p № 6) 15,12 15,12 х (N+1) Праймеры ПЦР-1 (p-p № 4) 4,5 15,12 х (N+1) Термостабильная ДНК-полимераза (p-p № 1) 0,25 0,25 х (N+1) Мезофильная ревертаза (p-p № 2) 0,13 0,13 х (N+1)
Мезофильная ревертаза и термостабильная ДНК-полимераза добавляется в последнюю очередь. После добавления всех компонентов смесь перемешивают пипетированием и разливают по пробиркам по 20 мкл. Затем в каждую пробирку добавляют по 5 мкл выделенной РНК. В пробирку с K+ добавляют 5 мкл РНК, выделенной из 20 мкл контрольной культуры, а в пробирку с K- добавляют 5 мкл деионизованной воды и перемешивают пипетированием. Если образовались капли на стенках пробирки, то их осаждают центрифугированием (1300 об/мин 5 - 10 секунд). На поверхность водной фазы осторожно наносят 40 мкл (2 - 3 капли) вазелинового масла. Пробы амплифицируют на амплификаторе. Температурный режим:
50 °C - 60 минут
95 °C - 5 минут 1 цикл
95 °C - 30 секунд
55 °C - 30 секунд 5 циклов
72 °C - 50 секунд
95 °C - 30 секунд
60 °C - 30 секунд 25 циклов
72 °C - 50 секунд
72 °C - 5 минут 1 цикл
После проведения амплификации проводят реакцию реамплификации. Реакцию реамплификации проводят согласно выше изложенному, но вместо 5 мкл РНК добавляют 5 мкл продукта ПЦР-1 и вместо праймеров ПЦР-1 добавляют праймеры ПЦР-2 (p-p № 5). Матрицу вносят в последнюю очередь. Смесь для ПЦР-2:Реактив на 1 пробу (мкл) на проб Реакционный буфер для ОТ-ПЦР (p-p № 6) 15,25 15,25 х (N+1) Праймеры ПЦР-2 (p-p № 4) 4,5 4,5 х (N+1) Термостабильная ДНК-полимераза (p-p № 1) 0,25 0,25 х (N+1)
Температурный режим циклов ПЦР:
95 °C - 30 секунд
55 °C - 30 секунд 5 циклов
72 °C - 50 секунд
95 °C - 30 секунд
60 °C - 30 секунд 25 циклов
72 °C - 50 секунд
72 °C - 5 минут 1 циклРеакция Матрица Праймеры Амплификация кДНК смесь праймеров № 1 Реамплификация 1-я амплификация смесь праймеров № 2
Соотношение циклов амплификации и реамплификации 30 : 30. Учет результатов амплификации. Результаты исследования учитываются путем анализа продуктов амплификации исследуемых образцов методом электрофореза в агарозном геле (Набор для проведения электрофореза). Приготовление буфера для электрофореза. Для приготовления 1 л однократного буфера для электрофореза к 20 мл 10 х TAE буфера добавить 980 мл дистиллированной воды и 25 мкл раствора бромистого этидия (p-p № 16). Буфер можно приготовить самостоятельно по следующей прописи: навеску 4,04 г триса растворяют в 200 мл дистиллированной воды, добавляют 1,14 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл 0,5 М раствора ЭДТА pH 8 и доводят объем буфера до 1000 мл дистиллированной водой. После растворения компонентов буфера добавляют 25 мкл раствора бромистого этидия (p-p № 16). Приготовление агарозного геля. К 100 мл однократного буфера для электрофореза добавляют 2 г агарозы, доводят до кипения и охлаждают до 45 °C . Заливают в специальную форму с гребенкой и дают затвердеть. Гребенку осторожно вынимают и форму с агарозой переносят в аппарат для горизонтального электрофореза (ПГ-9 <Диа - М>) и погружают в буфер. Электрофорез продуктов амплификации. К 7 мкл полученной амплификационной смеси (водной фазы) добавляют 1,5 мкл буфера для внесения образца (раствор № 7), перемешивают пипетированием и полученный образец вносят в лунки агарозного геля, образовавшиеся от зубцов гребенки. Электрофорез проводят при напряжении 8 вольт/см длины геля, в течение 60 минут. За это время краситель успевает пройти не менее половины геля. Направление движения образцов в геле от <минуса> к <плюсу>. Учет результатов электрофореза. Результаты электрофореза просматривают в ультрафиолетовом свете с длинной волны 254 нм на приборе <Трансиллюминатор>. После окрашивания результаты реакции выявляются в виде светящихся красноватых полос. Положительными (т. е. содержащими вирус ТГС) считаются пробы, в которых полосы в геле располагаются на таком же расстоянии от страта, что и полоса положительного контроля. Если в пробе содержится вирус РКВС, размер амплификационного фрагмента будет 192 - 253 п. н. (в зависимости от штамма). Исследуемые пробы считаются отрицательными, если в них не выявлено никаких полос или они не соответствуют по размеру фрагменту в положительном контроле (располагаются на другом расстоянии от страта). В отрицательном контроле не должно выявляться никаких полос. Размер фрагментов после проведения ПЦР на матрице РНК вируса ТГС и РКВС.Матрица Размер фрагментов ПЦР-1 ПЦР-2 Вирус ТГС 1006 п. н. 874 п. н. РКВС 325 -385 п. н. 192 - 253 п. н.
Полученные результаты можно документировать на фотопленке <Микрат - 300> аппаратом типа <Зенит> с оранжевым светофильтром. - Особые указания
- Строгое соблюдение условий хранения компонентов. Разовое (однократное) использование наконечников и пробирок. Ранее использованные и мытые наконечники и пробирки использовать нельзя. При составлении смеси для амплификации вначале готовить отрицательный контроль, а последним - положительный контроль. Посуда для отбора образцов биоматериала должна быть одноразовой или тщательно обработана хромпиком и отмыта. Пробирки с вирусным материалом должны быть всегда закрытыми. При отборе вируссодержащих суспензий работать наконечниками с фильтром. Перед открыванием пробирок капли жидкости на крышке удалять центрифугированием. При открывании и закрывании пробирок избегать случайного касания руками или инструментами внутренней поверхности крышек.
- Условия хранения
- Набор 1 - при температуре минус 20 °C, набор 2 и 3 - при температуре от 2 до 6 °C. Транспортирование производят в теплоизолирующей упаковке (термос, пенопластовая коробка) при температуре от минус 10 до минус 20 C). Срок годности - 6 месяцев.
- Производитель
- НАРВАК НПО ЗАО, Россия
Адрес: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 16.
Тел./факс: (495) 916-10-67, 916-17-05, 916-11-59,
190-75-61, 190-28-72, 190-30-54, 787-69-32, 787-69-33 - Продавец
- Место Вашей рекламы
По вопросам размещения информации
о ветеринарных препаратах и кормовых добавках
в Электронном справочнике "Ветеринарные препараты в России"
и заключения договоров на публикацию
обращайтесь в ООО "Ветторг" по электронной почте: vettorg@mail.ru
