ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРУСА ЧУМЫ ПЛОТОЯДНЫХ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР)
- Название (рус.)
- ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРУСА ЧУМЫ ПЛОТОЯДНЫХ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР)
- Состав и форма выпуска
- Состоит из трех наборов и рассчитана на проведение 50 анализов.
Наименование Количество Упаковка Набор 1 - для выделения РНК Раствор-1 32 мл 2 флакона Раствор-2 10 мл 1 флакон Раствор-3 10 мл 1 флакон Сорбент 2 мл 1 пробирка Вода деионизованная 2 мл 1 флакон Набор 2 - для выявления вируса ЧП методом ПЦР Фермент Tag-полимераза (5 ед/мкл) 25 мкл 1 пробирка Фермент MMLV ревертаза (200 ед/мкл) 8 мкл 1 пробирка Положительный контроль (вакцинный штамм вируса ЧП, лиофилизированный) на 2 мл раствора 2 флакона Праймеры для ПЦР-1 225 мкл 1 пробирка Праймеры для ПЦР-2 225 мкл 1 пробирка Буфер для ПЦР-1 760 мкл 1 пробирка Буфер для ПЦР-2 770 мкл 1 пробирка Масло 4 мл 1 флакон Набор - 3 для электрофореза Агароза 5 г 1 пакет Буфер для электрофореза (TAE, 50-кратный) 20 мл 1 флакон Бромистый этидий (10 мг/мл) 150 мкл 1 пробирка Буфер для нанесения образца на гель 300 мкл 1 пробирка
При точном соблюдении наставления по применению анализ занимает от 8 до 24 часов в зависимости от используемого оборудования. Компоненты наборов расфасовывают в полипропиленовые флаконы фирмы <Прометей> вместимостью 20 мл, микропробирки и пробирки фирмы Porex Bio Products Group (США) вместимостью 0,5 - 2 мл и 5 мл. На пробирки и флаконы наклеивают этикету с указанием краткого названия компонента. Флаконы и пробирки с компонентами упаковывают в полиэтиленовые пакеты с наименованием каждого набора. - Фармакологические свойства
- В основе лежит многократное повторение циклов денатурации исследуемой ДНК при температуре 94 °C, гибридизации ДНК со специфическими праймерами при температуре 53 °C и синтеза с них комплементарных цепей ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы при температуре 72 °C.. Поскольку геном вируса ЧП представлен молекулой РНК, полный анализ по его выявлению включает выделение суммарной РНК, получение кДНК и амплификацию специфического фрагмента ДНК в совмещенной реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции. В результате амплификации концентрация синтезированного фрагмента в исследуемой пробе увеличивается в миллионы раз, что позволяет визуально учитывать результаты анализа с помощью электрофореза в агарозном геле.
- Показания
- Для обнаружения вируса чумы плотоядных методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в крови, носовых и конъюнктивальных смывах от больных животных, в инфицированных культурах клеток и патматериале от умерших или вынужденно убитых животных (селезенка, сердце, печень).
- Дозы и способ применения
- Подготовка исследуемого материала. Подготовка исследуемых образцов: НОСОВЫЕ И КОНЪЮНКТИВАЛЬНЫЕ СМЫВЫ: Ватный тампон (или одноразовый шпатель), содержащий глазной смыв, переносят в пробирку с 5 мл физиологического раствора. После тщательного перемешивания тампон отжимают и удаляют. Для анализа используют 200 мкл полученной суспензии. КРОВЬ: допускается однократное замораживание при температуре от минус 8 °C до минус 20 °C. Для исследования берут 200 мкл крови. ТКАНИ: Ткани гомогенизируют в физиологическом растворе или в растворе-1 для выделения РНК. Для анализа используют 200 мкл гомогената. КОНТРОЛИ. При постановке каждой серии анализов включают положительный (K+) и отрицательный (K-) контроли. Положительным контролем выделения служит лиофилизированная вакцина (K+). Содержимое одного флакона растворить в 1 мл деионизованной воды, разделить на аликвоты по 200 мкл и хранить в замороженном состоянии (не выше минус 15 °C). Размораживать аликвоту непосредственно перед использованием. Неизрасходованный материал положительного контроля повторной заморозке не подлежит. Для исследования берут 200 мкл. Отрицательным контролем (K-) служит деионизованная вода. Выделение РНК из исследуемого биологического материала проводят с помощью Набора 1 для выделения РНК. В каждой серии анализов параллельно ставят реакции с положительным и отрицательным контролями. Смеси для контрольных образцов готовят по той же прописи, что и для исследуемых образцов. На всех этапах анализа в первую очередь проводят манипуляции с отрицательным контролем, затем с исследуемыми образцами и в последнюю очередь с положительным контролем. Во избежании перекрестной контаминации до начала работы маркируют чистые пробирки объемом 1,5 мл и вносят в них по 600 мкл раствора-1. После этого приступают к работе с инфицированным материалом. Образцы исследуемого биологического материала (в объеме до 200 мкл) добавляют в подготовленные пробирки, содержащие мкл раствора-1. Инкубируют 10 минут при комнатной температуре, периодически плавно перемешивая. Центрифугируют в настольной центрифуге типа <Эппендорф> 1 минуту при 13000 об/мин. Надосадочную жидкость переносят в чистые пробирки, а осадок отбрасывают. К надосадочной жидкости добавляют 40 мкл сорбента (сорбент перед использованием необходимо тщательно ресуспендировать), инкубируют при комнатной температуре в течение 10 минут, 1 - 2 раза перемешивая на смесители типа
. Центрифугируют 10 - 15 секунд на микроцентрифуге при 6000 - 13000 об/мин, надосадочную жидкость отбрасывают. К осадку добавляют 0,1 мл раствора-2, суспендируют и осаждают сорбент центрифугированием в течение 15 секунд, надосадочную жидкость отбрасывают. Процедуру повторяют 2 раза. К осадку добавляют 0,1 мл раствора-3, перемешивают, центрифугируют 15 секунд, надосадочную жидкость отбрасывают. Процедуру повторяют 2 раза. Осадок подсушивают в течение 5 - 10 минут при 56 °C в пробирке с отрытой крышкой. К осадку добавляют 30 мкл деионизованной воды для элюции РНК с сорбента, перемешивают и инкубируют 10 - 15 минут при 56 °C в закрытых пробирках. Центрифугируют в течение 0,5 минут при 13000 об/мин. Отобранную надосадочную жидкость используют для проведения ПЦР. На всех стадиях обработки биоматериала удаление супернатанта производить одноразовыми пластиковыми наконечниками при помощи вакуумного насоса в колбу-ловушку с дезинфицирующим раствором (3 % хлорамин или 5 % перекись водорода и т. п.). Реакция совмещенной обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ПЦР-1). Для выполнения вышеописанных стадий используют Набор 2 для выявления вируса ЧП методом ПЦР. В отдельной пробирке готовят общую реакционную смесь на N образцов, в число которых входят положительный и отрицательный контроли. Реактивы вносят в последовательности, приведенной в таблице. Работу желательно проводить на холоде. Реактив Количество на 1 пробу (мкл) Количество на N проб Буфер для ПЦР-1 15,125 15,125 х (N+1) Праймеры для ПЦР-1 4,5 4,5 х (N+1) Фермент Tag-полимераза 0,25 0,25 х (N+1) Фермент MMLV 0,125 0,125 х (N+1)
Ферменты добавляют в последнюю очередь. Смесь перемешивают, избегая образования пены, и немедленно раскапывают по 20 мкл в предварительно промаркированные пробирки, в каждую пробирку добавляют по 2 - 3 капли масла (примерно 40 мкл). Затем в них вносят по 5 мкл РНК соответствующих анализируемых или контрольных образцов, перемешивают (4 - 5 раз), затем пробы помещают в амплификатор со следующим температурным режимом:
50 ° C - 45 минут
94 °C - 5 минут 1 цикл
94 °C - 0,5 минут
53 °С - 0,5 минут 25 циклов
72 °C - 0,5 минут
Полимеразная цепная реакция. Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР-2). В отдельной пробирке готовят общую реакционную смесь на N образцов, в число которых входят положительный и отрицательный контроли. Реактивы вносят в последовательности, приведенной в таблице. Работу желательно проводить на холоде.Реактив Количество на 1 пробу (мкл) Количество на N проб Буфер для ПЦР-2 15,25 15,25 х (N+1) Праймеры для ПЦР-2 4,5 4,5 х (N+1) Tag-полимераза 0,25 0,25 х (N+1)
Реактивы смешивают в последовательности, как они перечислены в таблицы. Последним вносят фермент Tag-полимеразу. Смесь перемешивают и разливают по 20 мкл в предварительно промаркированные пробирки для ПЦР. В каждую пробирку добавляют по 2 - 3 капли масла (примерно 40 мкл). В последнюю очередь в соответствующие пробирки вносят по 5 мкл продукта реакции ПЦР0-1, перемешивают пипетированием (4 - 5 раз), затем пробы помещают в амплификатор со следующим температурным режимом:
94 °C - 0,5 минут
53 °C - 0,5 минут 25 циклов
72 °С - 0,5 минут
Продукты ПЦР-2 анализируют методом электрофореза в агарозном геле с помощью Набора 3 для электрофореза. Приготовление буфера для электрофореза. Для приготовления 1 л однократного буфера для электрофореза к 20 мл 50 х TAE буфера добавляют 980 мл дистиллированной воды и 40 мкл раствора бромистого этидия. Примечание: Буфер можно приготовить самостоятельно по следующей прописи: навеску 4,04 г основного триса растворяют в 200 мл дистиллированной воды, добавляют 1,14 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл 0,5 М раствора ЭДТА pH 8 и доводят объем буфера до 1000 мл дистиллированной водой. После растворения компонентов добавляют 40 мкл раствора бромистого этидия. Приготовление агарозного геля. В термостойкой посуде готовят необходимый объем 2 % суспензии агарозы на однократном буфере для электрофореза и нагревают на электроплите или в микроволновой печи до полного растворения агарозы. Расплавленную агарозу охлаждают до 45 °C, постоянно перемешивают, размешивают, заливают в специальную форму с гребенкой и дают затвердить. Форму с образовавшимся агарозным гелем переносят в аппарат для горизонтального электрофореза, погружают в буфер и осторожно вынимают гребенку. Оставшуюся часть затвердевшей агарозы можно повторно расплавить и использовать для приготовления геля. Электрофорез продуктов амплификации. В пробирки с исследуемыми образцами после завершения ПЦР-2 добавляют по 3 мкл буфера для нанесения образца, перемешивают пипетированием (4 - 5 раз), отбирают по 10 мкл окрашенной водной фазы и вносят в лунки агарозного геля, образовавшиеся от зубцов гребенки. Электрофорез проводят при напряжении 8 вольт/см длины геля до тех пор, пока краситель пройдет от старта не менее половины геля (примерно 30 - 60 минут). Направление движения образцов в геле от <минуса> к <плюсу>. Учет результатов электрофореза. Результаты электрофореза учитывают, просматривая гель в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе <Трансиллюминатор>. Амплифицированные фрагменты ДНК выявляются в виде светя
щихся красноватых полос.
Положительными считают пробы, полосы в которых располагаются в геле точно на таком же расстоянии от страта, что и полоса положительного контроля (фрагмент длиной 273 п. н.). В отрицательном контроле не должно выявляться никаких полос. Исследуемые пробы считают отрицательными, если в них не выявлено никаких полос. или полосы не соответствуют по размеру фрагменту в контрольной пробе (т. е. располагаются на другом расстоянии от страта). Присутствие в отрицательном контроле окрашенных фрагментов на уровне полос положительного контроля свидетельствует о перекрестной контаминации в процессе анализа. Результаты аннулируются. Анализ необходимо провести заново. Для документирования полученных результатов используют фотопленку <Микрат - 300> и аппарат типа <Зенит> с оранжевым светофильтром, либо другие фото- и видеосистемы. - Особые указания
- Бромистый этидий является мутагеном, проникающим через кожу. При работе с ним использовать резиновые перчатки. Бромистый этидий разлагается на свету и при нагревании. Содержащие его растворы хранят в темном месте. При длительном хранении или многократном нагревании в них следует внести свежую порцию (5 мкл на 100 мл буфера) бромистого этидия перед употреблением. Ультрафиолет вызывает ожоги слизистой оболочки глаз. При просмотре гелей пользоваться защитным экраном или очками. Строгое соблюдение условий хранения компонентов. Однократное использование пластиковой посуды. Ранее использованные и мытые наконечники и пробирки использовать нельзя. При составлении смеси для амплификации вначале готовить отрицательный контроль, а последним - положительный контроль. Посуда для отбора образцов биоматериала должна быть одноразовой или тщательно обработана хромпиком, отмыта, простерилизована.
- Условия хранения
- Набор 1 - при температуре от 2 до 6 °C, набор 2 - при температуре от минус 18 до минус 20 °C, набор 3 - при температуре от 2 до 6 °C. Транспортирование проводится при температуре от 0 °C до 2 °C. Срок годности - 12 месяцев.
- Производитель
- НАРВАК НПО ЗАО, Россия
Адрес: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 16.
Тел./факс: (495) 916-10-67, 916-17-05, 916-11-59,
190-75-61, 190-28-72, 190-30-54, 787-69-32, 787-69-33 - Продавец
- Место Вашей рекламы
По вопросам размещения информации
о ветеринарных препаратах и кормовых добавках
в Электронном справочнике "Ветеринарные препараты в России"
и заключения договоров на публикацию
обращайтесь в ООО "Ветторг" по электронной почте: vettorg@mail.ru
