ВЕТТОРГ ⇨ Каталог препаратов ⇨ ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ M. BOVIS И M. TUBERCULOSIS МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР)

ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ M. BOVIS И M. TUBERCULOSIS МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР)

Название (рус.)

Состав и форма выпуска

Состоит из трех наборов и рассчитана на выделение ДНК из 25 образцов и проведение 50 реакций ПЦР с двумя парами праймеров для двух видов микобактерий.

Наименование	Количество	Упаковка
Набор 1 - для выделения ДНК
Раствор-1	7,5 мл	1 флакон
Раствор-2	17 мл	1 флакон
Раствор-3	5 мл	1 флакон
Раствор-4	7,5 мл	1 флакон
Сорбент	0,5 мл	1 пробирка
Лизоцим	0,08 г	1 пробирка
Вода деионизованная	2 мл	1 флакон
Набор 2 - для определения ДНК микобактерий методом ПЦР
Буфер для ПЦР	1,6 мл	1 пробирка
Фермент Tag-полимераза (5 ед/мкл)	25 мкл	1 пробирка
Масло	4 мл	-
Комплект реагентов для детекции ДНК Mycobacterium bovis и Mycobacterium tuberculosis
Праймеры T2 и T2A для ПЦР-1	120 мкл	1 пробирка
Праймеры T4 и T4A для ПЦР-2	120 мкл	1 пробирка
Положительный контроль (вакцинный штамм M. bovis BCG, лиофилизированный)	0,5 мг	1 ампула
Комплект реагентов для детекции ДНК Mycobacterium tuberculosis
Праймеры T1 и T1A для ПЦР-1	120 мкл	1 пробирка
Праймеры T3 и T3A для ПЦР-2	120 мкл	1 пробирка
Положительный контроль (ДНК M. tuberculosis)	15 мкл	1 пробирка
Набор 3 - для электрофореза
Агароза	5 г	1 пакет
Буфер для электрофореза (TAE, 50-кратный)	20 мл	1 флакон
Бромистый этидий (10 мг/мл)	150 мкл	1 пробирка
Буфер нанесения образца на гель	300 мл	1 пробирка

Время проведения анализа при точном соблюдении наставления по применению занимает 8 - 16 часов. Компоненты наборов расфасовывают в полипропиленовые флаконы фирмы <Прометей> вместимостью 20 мл, микропробирки и пробирки фирмы Porex Bio Products Group (США) вместимостью 0,5 - 2 мл и 5 мл.

Фармакологические свойства

Тест-система, фактически, включает два набора для выявления микобактерий: один из них является универсальным и позволяет обнаружить как M. bovis, так и M. tuberculosis (Комплект реагентов для детекции ДНК Mycobacterium bovis и Mycobacterium tuberculosis), а другой предназначен для выявления M. tuberculosis (Комплект реагентов для детекции ДНК Mycobacterium tuberculosis). Идентификацию микобактерий проводят с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). В основе метода лежит многократное цикличное повторение трех процессов: тепловой денатурации ДНК; гибридизации (<отжига>) исследуемой ДНК со специфическими олигонуклеотидными зондами (праймерами); синтеза комплементарных цепей ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы. В результате проведения N циклов амплификации концентрация синтезированного фрагмента в исследуемой пробе увеличивается в 2n раз (например, в миллион раз после 20 циклов), что позволяет визуально учитывать результаты анализа с помощью электрофореза в агарозном геле. Для детекции микобактерий применяется двухступенчатая, так называемая, <гнездовая> модификация метода ПЦР с использованием внутренних и внешних праймеров. Для индикации суммарной ДНК Mycobacterium tuberculosis и Mycobacterium bovis используют внешние праймеры T2/Е2A в ПЦР-1 и внутренние T4/T4A в ПЦР-2. Для идентификации ДНК Mycobacterium tuberculosis используют внешние праймеры T1/T1A в ПЦР-1 и внутренние T3/T3A в ПЦР-2.

Показания

Для выявления и дифференцирования ДНК Mycobacterium bovis и Mycobacterium tuberculosis в патматериалах от животных, а также культурах микобактерий.

Дозы и способ применения

Подготовка исследуемого материала к работе. КРОВЬ: Используют без предварительной подготовки. Для анализа достаточно 200 мкл крови. ФАРИНГЕАЛЬНЫЕ СМЫВЫ: 5 - 10 мл центрифугируют при 5000 об/мин в течение 10 минут, надосадочную жидкость осторожно отбирают и отбрасывают так, чтобы над осадком осталось примерно 200 мкл жидкости. Осадок суспендируют в оставшемся над осадком объеме жидкости и переносят в полипропиленовую пробирку на 1,5 мл. В случае фарингеальных смывов суспензию используют для выделения ДНК. Надосадочную жидкость отбрасывают, осадок используют для выделения ДНК. БРОНЗИАЛЬНАЯ СЛИЗЬ: Используют без предварительной подготовки. Для анализа достаточно 200 мкл слизи. ОРГАНЫ: кусочки паренхиматозных органов, лимфоузлов (10 - 20 мг) измельчают ножницами и растирают до гомогенного состояния в физиологическом растворе. Для анализа используют 200 мкл полученной неосветленной суспензии. КОНТРОЛИ: Положительным контролем (K+) служит лиофилизированный вакцинный штамм M. bovis BCG. Содержимое одной ампулы растворить в 100 мкл деионизованной воды, разделить на аликвоты (от 25 до 100 мкл) и хранить в защищенном от света месте в замороженном состоянии (разведенная вакцина неустойчива на свету). Размораживать аликвоту непосредственно перед использованием. Неизрасходованный материал положительного контроля повторной заморозке не подлежит. Выделение ДНК из исследуемого биологического материала проводят с помощью Набора 1 - для выделения ДНК. Подготовка раствора. В раствор-1 добавляют лизоцим до конечной концентрации 10 мг/мл. Данный раствор готовят непосредственно перед употреблением и хранят не более 2 дней при температуре 4 °C. Во избежание перекрестной контаминации до начала работы маркируют чистые пробирки объемом 1,5 мл и вносят в них по 200 мкл раствора-1 с лизоцимом. После этого приступают к работе с инфицированным материалом. В подготовленные пробирки с раствором-1 (200 мкл с лизоцимом) вносят по 200 мкл исследуемого биологического материала, перемешивают на смесителе типа Vortex, инкубируют 10 минут при комнатной температуре, затем 15 минут при температуре 95 °C в воздушном или водяном термостате. Пробы центрифугируют в настольной центрифуге типа <Эппендорф> в течение 2 минут при 10000 - 13000 об/мин. Надосадочную жидкость отбирают для проведения анализа, а осадок отбрасывают. Примечание: чтобы избежать самопроизвольного открывания пробирок при нагревании, следует придавить их сверху грузом или использовать специальные пробирки с защелкой). К надосадочной жидкости добавляют 0,6 мл раствор-2 и 20 мкл сорбента перед использованием необходимо тщательно ресуспендировать). Пробы тщательно перемешивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут. Во время инкубации необходимо 3 - 5 раз встряхнуть пробирки, чтобы предотвратить выпадение сорбента на дно. Затем пробы центрифугируют 10 - 15 секунд при 10000 - 13000 об/мин для осаждения сорбента, надосадочную жидкость отбрасывают. К осадку добавляют 100 мкл раствора-3, перемешивают на смесителе, центрифугируют в течение 15 секунд. Супернатант отбрасывают. Процедуру повторяют 2 раза. К осадку добавляют 100 мкл раствора-4, перемешивают, центрифугируют в течение 15 секунд. Надосадочную жидкость отбрасывают. Процедуру повторяют 2 раза. Осадок подсушивают при 56 °C в течение 5 - 10 минут с открытой крышкой. К осадку добавляют 30 мкл деионизованной воды для элюции ДНК с сорбента, перемешивают и инкубируют 10 - 15 минут при 56 °C в закрытых пробирках. Центрифугируют в течение 0,5 минут при 13000 об/мин. Отобранную надосадочную жидкость используют для проведения ПЦР. На всех стадиях обработки биоматериала удаление супернатанта производить одноразовыми пластиковыми наконечниками при помощи водоструйного насоса в колбу-ловушку с дезинфицирующим раствором (3 % хлорамин или 5 % перекись водорода и т. п.). Работа с контрольными образцами. В каждой серии анализов параллельно проводят реакции с положительным и отрицательным контролями, при этом в первую очередь осуществляют все манипуляции с отрицательными контролями, затем с исследуемыми пробами и в последнюю очередь - с положительными контролями. Положительным контролем выделения ДНК служит вакцинный штамм V. bovis BCG. Для выделения ДНК достаточно 20 мкл. В качестве отрицательного контроля выделения ДНК используют деионизованную воду. Положительным контролем ПЦР служит ДНК M. tuberculosis. При постановке ПЦР для идентификации M. tuberculosis берут 5 мкл контрольной ДНК. В качестве отрицательного контроля ПЦР используют деионизованную воду. Полимеразная цепная реакция проводится с компонентами Набора 2 для определения ДНК микобактерий методом ПЦР Для каждой исследуемой пробы параллельно ставят две реакции. Одна из них позволяет обнаружить как M. bovis, так и M. tuberculosis с помощью универсальных праймеров (T2.T2A в ПЦР-1 и T4/T4A в ПЦР-2). Другая предназначена для выявления M. tuberculosis с помощью специфичных праймеров (T1/T1A в ПЦР-1 и T3/T3A в ПЦР-2). При постановке гнездовой ПЦР применяют следующие смеси праймеров:

Объект анализа	Праймеры ПЦР-1	Праймеры ПЦР-2
Mycobacterium bovis и Mycobacterium tuberculosis	T2/T2A	T4/T4A
Mycobacterium tuberculosis	T1/T1A	T3/T3A

Проведение первого раунда полимеразной цепной реакции (ПЦР-1). В отдельной пробирке готовят общую реакционную смесь на N образцов, в число которых входят положительные и отрицательные контроли. Реактивы вносят в последовательности, приведенной в таблице. Работу желательно проводить на холоде.

Реактив	Количество на 1 пробу (мкл)	Количество на N проб
Буфер для ПЦР-2	15,25	15,25 х (N+1)
Праймеры для ПЦР-2	4,5	4,5 х (N+1)
Tag-полимераза	0,25	0,25 х (N+1)

Реактивы смешивают в последовательности, как они перечислены в таблице. Последним добавляют фермент Tag-полимеразу. Смесь перемешивают и разливают по 20 мкл в предварительно промаркированные пробирки для ПЦР. В каждую пробирку вносят по 5 мкл исследуемой ДНК и осторожно, не касаясь стенок пробирок, наносят по 2 - 3 капли масла (примерно 40 мкл), затем пробы помещают в амплификатор со следующим температурным режимом:
95 °C - 42 секунды
62 °C - 46 секунд 25 циклов
72 °C - 48 секунд
Проведение второго раунда ПЦР (ПЦР-2). Все процедуры проводят также, как описано выше, со следующими изменениями: используют праймеры для ПЦР-2 (вместо ПЦР-1); в качестве матрицы используют 5 мкл продукта реакции ПЦР-1. Учет результатов амплификации - Продукты ПЦР-2 анализируют методом электрофореза в агарозном геле с помощью Набора 3 для электрофореза. Приготовления буфера для электрофореза. Для приготовления 1 л однократного буфера для электрофореза к 20 мл 50 х TAE буфера добавляют 980 мл дистиллированной воды и 40 мкл раствора бромистого этидия. Примечание: Буфер можно приготовить самостоятельно по следующей прописи: 4,04 г основного триса растворяют в 200 мл дистиллированной воды, добавляют 1,14 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл о,5 М раствора ЭДТА pH 8 и доводят объем буфера до 1000 мл дистиллированной водой. После растворения компонентов добавляют 40 мкл раствора бромистого этидия. Приготовление агарозного геля. В термостойкой посуде готовят необходимый объем 2 % суспензии агарозы на однократном буфере для электрофореза и нагревают на электроплите или в микроволной печи до полного растворения агарозы. Расплавленную агарозу охлаждают до 45 C, постоянно перемешивая, размешивают, заливают в специальную форму с гребенкой и дают затвердеть. Форму с образовавшимся агарозным гелем переносят в аппарат для горизонтального электрофореза, погружают в буфер и осторожно вынимают гребенку. Оставшуюся часть затвердевшей агарозы можно повторно расплавить и использовать для приготовления. Электрофорез продуктов амплификации. В пробирки с исследуемыми образцами после завершения ПЦР-2 добавляют по 3 мкл буфера для нанесения образца, перемешивают пипетированием (4 - 5 раз), отбирают по 10 мкл окрашенной водной фазы и вносят в лунки агарозного геля, образовавшиеся от зубцов гребенки. Электрофорез проводят при напряжении 8 вольт/см длины геля до тех пор, пока краситель пройдет от старта не менее половины геля (примерно 30 - 60 минут). Направление движения образцов в геле от <минуса> к <плюсу>. Учет результатов электрофореза. Результаты электрофореза учитывают просматривая гель в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе <Трансиллюминатор>. Амплифицированные фрагменты ДНК выявляются в виде светящихся красноватых полос.
Положительными считают пробы, полосы в которых располагаются в геле на таком же расстоянии от старта, что и полосы положительного контроля. В отрицательном контроле не должно выявляться никаких полос. Исследуемые пробы считают отрицательными, если в них не выявлено никаких полос или полосы не соответствуют по размеру фрагменту в контрольной пробе (т. е. располагаются на другом расстоянии от старта). Присутствие в отрицательном контроле окрашенных фрагментов на уровне полос положительного контроля свидетельствует о перекрестной контаминации в процессе анализа. Результаты аннулируются. Анализ необходимо провести заново. Для документирования полученных результатов используют фотопленку <Микрат -300> и аппарат типа <Зенит> с оранжевым светофильтром, либо другие фото- и видеосистемы. Интерпретация полученных результатов приведена в таблице:

Размер фрагмента в ПЦР-2 с используемыми праймерами	Интерпретация результатов
Универсальные для M. tuberculosis и M. bovis T2/T2A(ПЦР-1) T4/4A(ПЦР-2)	Специфичные для M. tuberculosis T1/T1A(ПЦР-1) T3/T3A(ПЦР-2) -
352 н. п.	377 н. п.	В пробе ДНК M. tuberculosis для ДНК M. tuberculosis и M. bovis.
352 н. п.	-	В пробе ДНК M. bovis.

Особые указания

Бромистый этидий является мутагеном, проникающим через кожу. При работе с ним использовать перчатки. Бромистый этидий разлагается на свету и при нагревании. Содержащие его растворы хранят в темном месте. При длительном хранении или многократном нагревании в них следует внести свежую порцию бромистого этидия (5 мкл на 100 мкл буфера) перед употреблением. Ультрафиолет вызывает ожоги слизистой оболочки глаз. При просмотре гелей пользоваться защитным экраном или очками. Строгое соблюдение условий хранения компонентов. Однократное использование пластиковой посуды. Ранее использованные и мытые наконечники и пробирки использовать нельзя. При составлении смеси для амплификации вначале готовить отрицательный контроль, а последним - положительный контроль. Посуда для отбора образцов биоматериала должна быть одноразовой или тщательно обработана хромпиком, отмыта, простерилизована.

Условия хранения

Набор 1 - при температуре от 2 до 6 °C, набор 2 - при температуре от минус 18 до минус 20 °C, набор 3 - при температуре от 2 до 6 °C. Транспортирование проводится при температуре от 0 °C до 2 °C. Срок годности - 12 месяцев.

Производитель

НАРВАК НПО ЗАО, Россия

Адрес: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 16.
Тел./факс: (495) 916-10-67, 916-17-05, 916-11-59,
190-75-61, 190-28-72, 190-30-54, 787-69-32, 787-69-33

Подробнее о производителе

Продавец

Место Вашей рекламы

По вопросам размещения информации

о ветеринарных препаратах и кормовых добавках

в Электронном справочнике "Ветеринарные препараты в России"

и заключения договоров на публикацию

обращайтесь в ООО "Ветторг" по электронной почте: vettorg@mail.ru