РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ПРИМЕНЕНИЮ ТИМОГЕНА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ НЕЗРЕЛЫХ ЦЫПЛЯТ (ГИПОТРОФИКОВ) В РАННИЕ СРОКИ ПОСТНАТАЛЬНОГО ОНТОГЕНЕЗА
Рекомендации разработаны Н.В. Садовниковым, С.И. Лютинским, Г.П. Грачевой.
Введение
В последние годы успешно развивается новое научное направление – биорегулирующая терапия, где наряду
с традиционными лекарственными средствами предусматривается использование новых биорегулирующих препаратов – цитомединов, представляющих собой пептиды с молекулярной массой 1000 – 10 000 Да. Цитомедины участвуют в регуляции функциональной активности тех клеточных популяций, которые послужили исходным материалом для их выделения. Пептидные медиаторы способны влиять не только на здоровые клетки, они оказывают положительное воздействие
и на метаболические процессы в клетках поврежденных, нормализуя их функции. К настоящему времени цитомедины выделены из почти из всех тканей и органов животного организма, однако наиболее полно изучена функциональная активность пептидных биорегуляторов из органов иммунной системы. Созданные на их основе лекарственные препараты способствуют сохранению и восстановлению нарушенного гомеостаза. В результате обширных экспериментальных исследований цитомединов, выделенных из тимуса, была определена наиболее активная фракция, на основе которой создан высокоэффективный синтетический лечебный препарат – тимоген.
Как и в других отраслях животноводства, в птицеводстве намечают перспективные пути применения биорегуляторных пептидов. Это профилактика заболеваний, повышение адаптационных возможностей у цыплят, ускорение структурно-функционального становления их тканей, органов, организма в целом.
Целью предпринятого исследования было изучение количественных характеристик неспецифической резистентности цыплят разной степени физиологической зрелости после экзогенного применения им тимогена, его влияние на рост
и развитие птицы.
Методы исследований иммунной и кроветворной системы у цыплят
2.1. Подсчет морфологических показателей крови у цыплят
Подсчет эритроцитов и лейкоцитов осуществляли одновременно в камере Горяева по общепринятой методике, для чего кровь разводили красителем в меланжере для эритроцитов. Лейкоциты окрашивались в фиолетовый цвет, тогда как эритроциты оставались неокрашенными. Для подсчета количества миелокариоцитов брали красный костный мозг большеберцовой кости, гомогенизировали в изотоническом растворе и разбавляли 3% уксусной кислотой, используя камеру Горяева. Остальные гематологические показатели определяли общепринятыми методиками.
Содержание Т-клеток выявляли реакцией на альфа-нафтил-бутиратэстеразу (Higgy et al., 1978).
2.2. Определение содержания иммуноглобулина G в сыворотке крови цыплят
Определяли содержание IgG в сыворотке крови цыплят по методу радиальной иммунодиффузии по Fahey and Mc Kelvey
с помощью моноклональных антител по методу Манчини (1965) в модификации Л.С. Колабской (1980). Его принцип заключается в образовании кольца преципитации в результате взаимодействия смеси агара с антисывороткой к IgG
и антигена исследуемой сыворотки крови цыплят, внесенной в лунки агаровой пластинки.
Площадь преципитата прямо пропорциональна количеству внесенного в лунку антигена и обратно пропорциональна концентрации антител в агаре. При этом между концентрацией испытуемого антигена и площадью преципитата имеется линейная зависимость.
2.3. Методы исследования иммунокомпетентной (ИКС) системы у цыплят
Кусочки исследуемых органов фиксировали в жидкости Карнца и по общепринятой методике заливали в парафин. Срезы толщиной 5 мкм окрашивали гемотоксилин-эозином.
Проводили морфометрию органов и клеток. С помощью окулярной сетки определяли плотность клеток на единице площади и размеры коркового, мозгового вещества и диаметр фолликулов, лимфоидных органов.
О состоянии пролиферативных процессов в иммунокомпетентных органах судили по величине пролиферативного пула (S+G2/M) клеток (доля клеток, находящихся в стадии синтетических реакций и стадии деления).
Цитофлуориметрическое определение количества ДНК в ядрах клеток проводили с помощью метода проточной цитометрии. Измеряли от 5 тыс. до 10 тыс. клеток через 2-3 часа после окраски. На основе анализа полученных ДНК-гистограмм определяли плотность клеточных ядер с распределением анализируемой клеточной популяции по периодам митотического цикла.
Влияние Тимогена на рост и развитие цыплят разной степени физиологической зрелости
В пятисуточном возрасте отбирали здоровых интактных цыплят и цыплят с низкой степенью физиологической зрелости (гипотрофики), которых отсортировывали по малой массе тела, слабой подвижности, увеличенному животу, слипшемуся загрязненному пуху, цианозу слизистых оболочек. Всего было сформировано 4 группы по 50 голов в каждой: 1-я – интактные цыплята (нормотрофики); 2-я – цыплята в состоянии гипотрофии (контроль); 3-я – гипотрофичные цыплята, получившие
в 5-ти суточном возрасте аэрозольным методом введения дозу тимогена из расчета 400 мкг на 1м3 (опыт), и 4-я группа, состоящая из физиологически незрелых цыплят, которым внутримышечным методом однократно вводили 10 мкг/кг массы тела 0,01% раствор тимогена.
Для физиологически незрелых цыплят отставание массы тела для данного возраста от массы тела нормальных цыплят считалось значительным, если разница составляла две величины среднего квадратического отклонения массы тела
в группе гипотрофичных цыплят и средней величиной массы тела по группе состоящей из здоровых цыплят.
Наблюдение за динамикой роста и развития цыплят в ранний постнатальный период жизни указывает на наличие дефицита массы тела у цыплят из группы цыплят-гипотрофиков (контроль) на протяжении всего опытного периода (табл.1).
В то же время обращает на себя внимание тот факт, что в опытных группах цыплята-гипотрофики, подвергавшиеся аэрозольной обработке тимогеном, уже к 30 суткам набирали массу тела, соизмеримую с таковой у здоровых цыплят.
В последующие сроки исследования достоверных различий массы тела цыплят опытных групп и массой тела здоровых цыплят
не определялось.
Под воздействием тимогена, через 25 суток после его введения у цыплят-гипотрофиков происходило увеличение количества эритроцитов (1,85 ±0,04•1012/л), лейкоцитов (26,6±3,1х109/л) Р<0,02, с преобладанием в периферической крови
Т-лимфоцитов (54,8±1,2%).
Таблица 1
Изменение массы тела цыплят-гипотрофиков в постнатальном онтогенезе
Величина гематокрита и концентрация гемоглобина также были достоверно выше у цыплят, для лечения которых применялся синтетический пептид тимуса, по сравнению в аналогичными показателями цыплят-гипотрофиков контрольной группы (30,0±1,4% и 27,6±0,6% — Р<0,05; 1,18±0,04 ммоль/л и 1,09 ±0,003 ммоль/л- Р<0,05, соответственно).
В то же время интактные цыплята гипотрофики отставали в приросте живой массы на 20% (Р<0,05) от величины соответствующего показателя цыплят опытных групп. Через 55 суток после введения тимогена у цыплят опытных групп
в крови увеличивалось количество эритроцитов до 2,16±0,10 •1012/л – 2,45±0,20•1012/л, Р<0,05, по сравнению с количеством эритроцитов у цыплят-гипотрофиков в контрольной группе (1,49±0,18•1012/л). Концентрация гемоглобина и гематокритная величина в крови цыплят опытных групп приближалась в этом возрасте к таковым величинам крови у клинически здоровых цыплят. Средняя концентрация гемоглобина в одном эритроците (СКГЭР) возрастала в крови цыплят опытных групп до 25,0±1,9%, Р<0,05 и заметно отличалась по величине от цыплят-гипотрофиков контрольной группы (22,2 ±0,5%).
К этому возрасту у цыплят опытных групп в красном костном мозге увеличивалось и количество миелокариоцитов (463,0±12,29•109/л) по сравнению с их количеством в костном мозге у цыплят-гипотрофиков контрольных групп (343, 2±15,02•109/л).
Количество лейкоцитов в периферической крови также было выше (29,3±3,0•109/л, Р<0,025) по сравнению с количеством лейкоцитов в крови у физиологически незрелых цыплят контрольной группы (12.5±1,10•109/л).
В 16-ти суточном возрасте у цыплят-гипотрофиков определялось низкое содержание IgG в сыворотке крови физиологически незрелых цыплят контрольной группы (3,1±0,1г/л, Р<0,001) по сравнению с количеством иммуноглобулина G в сыворотке крови у здоровых цыплят (4,5±0,1 г/л). У цыплят-гипотрофиков опытных групп уровень иммуноглобулина G был выше, начиная с 16-ти и до 30-ти суточного возраста (4,3±0,4 – 6,36±0,4 г/л), Р<0,025.
В 60-ти суточном возрасте у цыплят всех групп происходило повышение количества иммуноглобулина G в среднем на 42% (Р<0,05), по сравнению с их количеством в крови у цыплят более ранних сроков постнатального периода. Максимальным их количество было 4,5±0,8 – 7,9±0,9 г/л у цыплят опытных групп; у цыплят в состоянии гипотрофии было 7,3±0,7 г/л;
у клинически здоровых цыплят – 5,8±0,1г/л.
К 90-та суточному возрасту цыплят опытных групп наблюдалось повышение IgG на 20,3% (Р<0,05), у клинически здоровых цыплят (нормотрофиков) на 34,4% (Р<0,05), а у цыплят в состоянии гипотрофии количество IgG не менялось по сравнению
с их количеством в сыворотке крови у 60-ти суточных цыплят.
Из этого видно, что аэрозольное и внутримышечное введение тимогена гипотрофичным цыплятам в 5-ти суточном возрасте индуцировало повышение IgG в сыворотке крови у физиологически незрелых цыплят в ранние сроки постнатального онтгогенеза.
Влияние тимогена на морфофункциональное состояние иммунокомпетентной системы (ИКС) физиологически незрелых цыплят.
4.1. Морфофункциональное состояние тимуса, селезенки и бурсы Фабрициуса у цыплят гипотрофиков оценивали с помощью морфометрического метода, гистохимии и методом проточной ДНК-цитометрии у цыплят в ранние сроки постнатального онтогенеза.
Установлено, что в 15-ти суточном возрасте у гипотрофичных цыплят снижена величина пролиферативного пула клеток
в бурсе Фабрициуса на 31% (Р<0,001), селезенки на 33% (Р<0,01) и в крови на 39,7% (Р<0,05). Величина пролиферативного пула клеток в тимусе гипотрофичных и здоровых цыплят существенно не различалась. Однако в возрасте 30-ти суток у цыплят-гипотрофиков контрольной группы обнаружено в тимусе уменьшение ширины коркового вещества (147,0±8,1мкм, Р<0,05), и клеточности коркового (62,0±2,0 на 100 мкм2, Р<0,05) и мозгового вещества (36,0±1,5 на 100 мкм2, Р<0,001),
по сравнению с таковыми величинами структур тимуса у здоровых цыплят.
В селезенке уменьшены размеры лимфоидных фолликулов на 13,9% (Р<0,05) и на 37,0% (Р<0,01) снижено количество лейкоцитов в красной пульпе органа. В бурсе Фабрициуса сужена ширина коркового вещества (26,1±0,8мкм, Р<0,025) и мозгового (167±4,9 мкм, Р<0,001) вещества и уменьшена клеточность коркового вещества на 18% (Р<0,001), по сравнению с таковыми показателями у здоровых цыплят.
Аэрозольное и внутримышечное введение тимогена в дозе 400мкг/м3 и 10мкг/кг цыплятам-гипотрофикам опытных групп приводило к увеличению пролиферативных процессов в тканях (ИКС) через 10-25 суток. Величина пролиферативного пула клеток в лимфоидных органах увеличивалась до уровня показателей здоровых цыплят.
Так в 15-ти суточном возрасте у цыплят опытных групп была обнаружена стимуляция пролиферативных процессов в бурсе Фабрициуса на 158% и в селезенке на 83,3%.
Это приводило и к нормализации морфометрических показателей в тканях ИКС, так ширина коркового вещества в тимусе опытных цыплят была 283,0±20,3мкм, после введения 10 мкг/кг и 280,0±12,3 мкм, после введения 400мкг/м3; ширина мозгового вещества увеличивалась в тимусе до 500,0±31,0мкм, после введения 5-ти суточным цыплятам 10мкг/кг тимогена
и до 400,0±20,0 мкм, после введения 400мкг/м3 тимогена.
К 30 суткам отмечалось общее снижение активности пролиферативных процессов в лимфоидных органах. В бурсе Фабрициуса у цыплят опытных групп в возрасте 30-ти суток установлено увеличение ширины коркового вещества до 57,0±2,9 мкм, после применения 10мкг/кг и до 32,7±1,4 мкм после применения тимогена в дозе в 400 мкг/м3, ширина мозгового вещества была увеличена до 184,0±5,0мкм.
В селезенке происходила нормализация показателей характеризующих состояние белой пульпы, однако количество лейкоцитов в красной пульпе оставалось сниженным на 28,3% (Р<0,05).
Таким образом, наблюдение за развитием и ростом цыплят во время опыта показало отставание в приросте массы тела
у цыплят-гипотрофиков контрольной группы. В центральных и периферических органах иммунной системы у цыплят этой группы наблюдалось торможение пролиферативных процессов, снижение показателей гемограммы, Т-лимфоцитов
в периферической крови, низкое содержание IgG — глобулинов в сыворотке крови.
Введение аэрозольным путем тимогена физиологически незрелым цыплятам в 5-ти суточном возрасте стимулировало активность пролиферативных процессов в иммунных органах и приводило к нормализации лимфопоэтической функции и улучшению показателей периферической крови.
Полученные нами данные могут служить подтверждением того, что предположение об иммунорегулирующем действии тимогена и других препаратов, полученных из тимуса, направлено на ускорение превращения костномозговых предшественников Т-клеток в тимоциты, а на этапе созревания ускорение их дифференцировки в системе Т- и В-лимфоцитов. У цыплят-гипотрофиков опытных групп к месячному возрасту постнатальной жизни нормализовались не только показатели белой крови, но и число эритроцитов увеличивалось до уровня величин здоровых цыплят. В органах ИКС происходила структурно-функциональная перестройка, направленная на повышение иммунологической реактивности
у цыплят. Существенно улучшились показатели гуморального иммунитета. Нормализация состояния иммунной системы цыплят-гипотрофиков сопровождалась снижением дефицита живой массы тела в опытных группах, что и дало основание для применения тимогена в качестве патогенетического средства для лечения цыплят-гипотрофиков на ранних стадиях постнатального периода жизни.
Среднесуточный прирост живой массы за 90 дней у цыплят-гипотрофиков контрольной группы составил в среднем 9,3 гр.;
у цыплят-гипотрофиков опытной группы – 13,9 гр.; у здоровых цыплят контрольной группы – 12,8 грамма. Сохранность поголовья увеличивалась на 1,8 – 2,4%.
Практические предложения
5.1 Тимоген может применяться в птицеводстве в качестве иммуномодулятора, так как после его применения у физиологически незрелых цыплят повышался пролиферативный пул клеток в иммунных органах (тимусе, бурсе Фабрициуса, селезенке), а также ускорялось их структурно-функциональное становление, повышалась жизнеспособность ослабленного молодняка и усиливалась интенсивность их роста.
5.2. Аэрозольный и внутримышечный методы введения тимогена дают равнозначные результаты воздействия на иммунные органы у гипотрофичных цыплят.
5.3. Тимоген, используемый в виде аэрозоля при концентрации 400 мкг/м3 следует применять после сортировки ослабленным цыплятам на 5-7 сутки постнатальной жизни с экспозицией 45 минут, в специализированном герметизированном помещении. В камеру объемом 30 м3 загружается 6 тыс. цыплят и в ней распыляется 60 мл – 0,01% раствора тимогена с добавлением адъюванта глицерина аппаратом САГ – 1.
5.4. При необходимости, гипотрофичные цыплята могут быть подвергнуты повторной обработке тимогеном в 15-17-ти суточном возрасте путем индивидуальных внутримышечных инъекций из расчета 10мкг/кг живой массы. С этой целью берут 2,5 мл – 0,01% раствора тимогена и добавляют его к 500 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида. Внутримышечно на одного цыпленка вводят 0,1 мл раствора тимогена на каждые 50 граммов массы тела
