ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ПАТОГЕННЫХ ЛЕПТОСПИР МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР)
- Название (рус.)
- ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ПАТОГЕННЫХ ЛЕПТОСПИР МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР)
- Состав и форма выпуска
- Состоит из 3 наборов и рассчитана на проведение 50 диагностических исследований.
Наименование Количество Упаковка Набор 1 - для выделения РНК Раствор-1 10 мл 1 флакона Раствор-2 32 мл 1 флакон Раствор-3 10 мл 1 флакон Сорбент 1 мл 1 пробирка Вода деионизованная 2 мл 1 флакон Набор 2 - определения ДНК патогенных лептоспир методом ПЦР Праймеры для ПЦР-1 225 мкл 1 пробирка Праймеры для ПЦР-2 225 мкл 1 пробирка Положительный контроль (инактивированная культура лептоспир) 0,5 мкл 1 пробирка Положительный контроль (ДНК лептоспир) 25 мкл 1 пробирка Буфер для ПЦР 1,6 мл 1 пробирка Фермент Tag-полимераза (5 ед/мкл) 25 мкл 1 пробирка Масло 4 мл 1 флакон Набор 3 - для электрофореза Агароза 5 г 1 пакет Буфер для электрофореза (TAE, 50-кратный) 20 мл 1 флакон Бромистый этидий (10 мг/мл) 150 мкл 1 пробирка Буфер для нанесения образца на гель 300 мкл 1 пробирка
Время проведения анализа при точном соблюдении наставления по применению составляет 8 - 16 ч в зависимости от используемого оборудования. Компоненты наборов расфасовывают в полипропиленовые флаконы фирмы <Прометей> вместимостью 20 мл, микропробирки и пробирки фирмы Porex Bio Products Group (США) вместимостью 0,5 - 2 мл и 5 мл. На пробирки и флаконы наклеивают этикетку с указанием краткого названия компонента. Флаконы и пробирки с компонентами упаковывают в полиэтиленовые пакеты с наименованием каждого набора. - Фармакологические свойства
- Идентификация лептоспир проводится с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). В основе метода лежит многократное цикличное повторение трех процессов: тепловая денатурация ДНК в исследуемой пробе при 94 °C; гибридизация (<отжиг>) исследуемой ДНК со специфическими олигонуклеотидными зондами (праймерами) при 55 °C; синтез комплементарных цепей ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы при 72 °C. Для детекции лептоспир применяется двухступенчатая (т. н. <гнездовая>) модификация метода ПЦР с использованием внутренних и внешних праймеров. Для идентификации ДНК лептоспир используются праймеры для ПЦР-1 (внешние) и для ПЦР-2 (внутренние). Праймеры предназначены для определения 15 серовариантов Leptospira interrogans. В результате проведения N циклов амплификации концентрация синтезированного фрагмента в исследуемой пробе увеличивается в 2 раза (например, в миллион раз после 20 циклов), что позволяет визуально учитывать результаты анализа с помощью электрофореза ДНК в агарозном геле.
- Показания
- Предназначена для выявления 15 наиболее распространенных серогрупп Leptospira interogans в образцах крови и мочи животных (прижизненно), в патматериалах от умерших или вынужденно убитых животных (кровь, органы) и в культуральных образцах. Включает 50 диагностических исследований
- Дозы и способ применения
- Отбор проб и их доставка в лабораторию производится согласно ГОСТ 25386-91 <Животные сельскохозяйственные. Методы лабораторной диагностики лептоспироза>. Для каждого образца используется строго индивидуальный стерильный инструмент и емкость. Подготовка исследуемого материала. КРОВЬ: Используют без предварительной подготовки. Для анализа достаточно 200 мкл крови. МОЧА: 5 - 10 мл центрифугируют при 5000 об/мин. в течение 10 минут, надосадочную жидкость осторожно отбирают и отбрасывают так, чтоб над осадком осталось примерно 200 мкл жидкости. Осадок суспендируют в оставшемся над осадком объеме жидкости и переносят в полипропиленовую пробирку на 1,5 мл. ОРГАНЫ: кусочки паренхиматозных органов, лимфоузлов (10 - 20 мг) измельчают ножницами и растирают до гомогенного состояния в физиологическом растворе. Для анализа используют 200 мкл полученной неосветленной суспензии. Выделение ДНК из исследуемого биологического материала проводят с помощью Набора 1 - для выделения ДНК. Во избежание перекрестной контаминации до начала работы маркируют чистые пробирки объемом 1,5 мл и вносят в них по 200 мкл раствора-1. После этого приступают к работе с инфицированным материалом. В подготовительные пробирки с раствором-1 (200 мкл) вносят по 200 мкл исследуемого биологического материала, перемешивают на смесителе типа Vortex и инкубируют 20 минут при температуре 95 °C в воздушном или водяном термостате. Пробы центрифугируют в настольной центрифуге типа <Эппендорф> в течение 2 минут при 10000 - 13000 об/мин. Надосадочную жидкость отбирают для проведения анализа, а осадок отбрасывают. Примечание: чтобы избежать самопроизвольного открывания пробирок при нагревании, следует придавить их грузом или использовать специальные пробирки с защелкой. К надосадочной жидкости добавляют 0,6 мл раствора-2 и 20 мкл сорбента (сорбент перед использованием необходимо тщательно ресуспендировать). Пробы тщательно перемешивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут. Во время инкубации необходимо 3 - 5 раз встряхнуть пробирки, чтобы предотвратить выпадение сорбента на дно. Затем пробы центрифугируют 10 - 15 секунд при 10000 - 13000 об/мин для осаждения сорбента, надосадочную жидкость отбрасывают. К осадку добавляют 100 мкл раствора-3, перемешивают на смесителе, центрифугируют в течение 15 секунд. Супернатант отбрасывают. Процедуру повторяют 2 раза. К осадку добавляют 100 мкл раствора-4, перемешивают, центрифугируют в течение 15 секунд. Надосадочную жидкость отбрасывают. Процедуру повторяют 2 раза. Осадок подсушивают при 56 °C в течение 10 - 15 минут в пробирке с открытой крышкой. К осадку добавляют 30 мкл деионизованной воды для элюции ДНК с сорбента, перемешивают и инкубируют 10 - 15 минут при 56 °C в закрытых пробирках. Центрифугируют в течение 1 минуты при 13000 об/мин. Отобранную надосадочную жидкость используют для проведения ПЦР. На всех стадиях обработки биоматериала удаление супернатанта производить одноразовыми пластиковыми наконечниками при помощи вакуумного насоса в колбу-ловушку с дезинфицирующим раствором (3 % хлорамин или 5 % перекись водорода и т. ж.). Работа с контрольными образцами. В каждой серии анализов на стадиях параллельно проводят реакции с положительным и отрицательным контролями, при этом в первую очередь осуществляют все манипуляции с отрицательными контролями, затем с исследуемыми пробам и в последнюю очередь - с положительными контролями. Положительным контролем выделения ДНК служит инактивированная культура лептоспир. Для выделения ДНК достаточно 50 мкл культуры. В качестве отрицательного контроля выделения ДНК используют деионизованную воду или питательную среду для культивирования лептоспир. Выделенную из инактивированной культуры ДНК используют в реакции амплификации наряду с другими пробами. Неизрасходованную часть выделенной ДНК лептоспир можно заморозить и в дальнейшем использовать в качестве положительного контроля ПЦР. Положительным контролем ПЦР служит ДНК лептоспир из Набора 2 для определения ДНК патогенных лептоспир методом ПЦР. При постановке ПЦР берут 5 мкл контрольной ДНК. В качестве отрицательного контроля ПЦР используют деионизованную воду. Полимеразная цепная реакция проводится с помощью Набора 2 для определения ДНК патогенных лептоспир методом ПЦР. Проведение первого раунда полимеразной цепной реакции (ПЦР-1): В отдельной пробирке готовят общую реакционную смесь на N образцов, в число которых входят положительный и отрицательный контроли. Реактивы вносят в последовательности, приведенной в таблице. Работу желательно проводить на холоде.
Реактив Количество на 1 пробу (мкл) Количество на N проб Буфер для ПЦР-2 15,25 15,25 х (N+1) Праймеры для ПЦР-2 4,5 4,5 х (N+1) Tag-полимераза 0,25 0,25 х (N+1)
Реактивы смешивают в последовательности, как они перечислены в таблице. Последним добавляют фермент Tag-полимеразу. Смесь перемешивают и разливают по 20 мкл в предварительно промаркированные пробирки для ПЦР. В каждую пробирку вносят по 5 мкл исследуемой ДНК и осторожно, не касаясь стенок пробирок, наносят по 2 - 3 капли масла (примерно 40 мкл), затем пробы помещают в амплификатор со следующим температурным режимом:
94 °C - 0,5 минут
55 °C - 0,5 минут 25 циклов
72 °C - 0,5 минут
Проведение второго раунда ПЦР (ПЦР-2). Все процедуры проводят так же, как описано выше, со следующими изменениями: используют праймеры для ПЦР-2 (вместо ПЦР-2); в качестве матрицы используют 5 мкл продукта реакции ПЦР-1. Учет результатов амплификации - Продукты ПЦР-2 анализируют методом электрофореза в агарозном геле с помощью Набора 3 для электрофореза. Приготовление буфера для электрофореза. Для приготовления 1 л однократного буфера для электрофореза к 20 мкл 50 х TAE буфера добавляют 980 мл дистиллированной воды и 40 мкл раствора бромистого этидия. Примечание: Буфер можно приготовить самостоятельно по следующей прописи: навеску 4,04 г основного триса растворяют в 200 мл дистиллированной воды, добавляют 1,14 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл 0,5 М раствора ЭДТА pH 8 и доводят объем буфера до 1000 мл дистиллированной водой. После растворения компонентов добавляют 40 мкл раствора бромистого эдития. Приготовление агарозного геля. В термостойкой посуде готовят необходимый объем 2 % суспензии агарозы на однократном буфере для электрофореза и нагревают на электроплите или в микроволновой печи до полного растворения агарозы. Расплавленную агарозу охлаждают до 45 °C, постоянно перемешивая, размешивают, заливают в специальную форму с гребенкой и дают затвердеть. Форму с образовавшимся агарозным гелем переносят в аппарат для горизонтального электрофореза, погружают в буфер и осторожно вынимают гребенку. Оставшуюся часть затвердевшей агарозы можно повторно расплавить и использовать для приготовления геля. Электрофорез продуктов амплификации. В пробирки с исследуемыми образцами после завершения ПЦР-2 добавляют по 3 мкл буфера для нанесения образа, перемешивают пипетированием (4 - 5 раз), отбирают по 10 мкл окрашенной водной фазы и вносят в лунки агарозного геля, образовавшиеся от зубцов гребенки. Электрофорез проводят при напряжении 8 вольт/см длины геля до тех пор, пока краситель пройдет от старта не менее половины геля (примерно 30 - 60 минут). Направление движения образцов в геле от <минуса> к <плюсу>. Учет результатов электрофореза. Результаты электрофореза учитывают, просматривая гель в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе <Трансиллюминатор>. Амплифицированные фрагменты ДНК выявляются в виде светящихся красноватых полос.
Положительными считают пробы, полосы в которых располагаются в геле точно на таком же расстоянии от старта, что и полоса положительного контроля (фрагмент длиной 180 п. н.). В отрицательном контроле не должно выявляться никаких полос. Исследуемые пробы считают отрицательными, если в них не выявлено никаких полос или полосы не соответствуют по размеру фрагменту в контрольной пробе (т. е. располагаются на другом на другом расстоянии от старта). Присутствие в отрицательном контроле окрашенных фрагментов на уровне полос положительного контроля свидетельствует о перекрестной контаминации в процессе анализа. Результаты аннулируются. Анализ необходимо провести заново. Для документирования полученных результатов используют фотопленку <Микрат - 300> и аппарат типа <Зенит> с оранжевым светофильтром, либо другие фото- и видеосистемы. - Особые указания
- Положительными считают пробы, полосы в которых располагаются в геле точно на таком же расстоянии от старта, что и полоса положительного контроля (фрагмент длиной 180 п. н.). В отрицательном контроле не должно выявляться никаких полос. Исследуемые пробы считают отрицательными, если в них не выявлено никаких полос или полосы не соответствуют по размеру фрагменту в контрольной пробе (т. е. располагаются на другом на другом расстоянии от старта). Присутствие в отрицательном контроле окрашенных фрагментов на уровне полос положительного контроля свидетельствует о перекрестной контаминации в процессе анализа. Результаты аннулируются. Анализ необходимо провести заново. Для документирования полученных результатов используют фотопленку <Микрат - 300> и аппарат типа <Зенит> с оранжевым светофильтром, либо другие фото- и видеосистемы.
- Условия хранения
- Набор 1 - при температуре от 2 до 6 °C, набор 2 - при температуре от минус 18 до минус 20 °C, набор 3 - при температуре от 2 до 6 °C. Транспортирование проводится при температуре от 0 °C до 2 °C. Срок годности - 12 месяцев.
- Производитель
- НАРВАК НПО ЗАО, Россия
Адрес: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 16.
Тел./факс: (495) 916-10-67, 916-17-05, 916-11-59,
190-75-61, 190-28-72, 190-30-54, 787-69-32, 787-69-33 - Продавец
- Место Вашей рекламы
По вопросам размещения информации
о ветеринарных препаратах и кормовых добавках
в Электронном справочнике "Ветеринарные препараты в России"
и заключения договоров на публикацию
обращайтесь в ООО "Ветторг" по электронной почте: vettorg@mail.ru
